肌萎縮側索硬化患者血漿轉化生長因子-α水平的變化及其意義

閻俊，李作漢，章文斌，徐運

肌萎縮側索硬化(ALS)是致死性的神經系統變性疾病，死于該病的患者估計全球每年約有3萬人，該疾病病程短、進展很快，平均生存期約為24～48個月[1]。迄今為止，選擇性運動神經元受累變性的發病機制還尚不明了，炎癥機制是其中的可能因素之一[2]。自從1995年抑制谷氨酸興奮性毒性作用的力如太被美國食品藥品管理局批準用于治療該疾病以來，有超過60類藥物分子被用于嘗試治療ALS，但大多數的藥物實驗并未取得預期療效[1]。探尋該疾病的病理機制，尋找針對機制的有效治療藥物，延長患者的病程迫在眉睫。CNS損傷后，繼發的神經炎癥反應中激活的小膠質細胞扮演著重要的角色。轉化生長因子-α(TGF-α)與主要表達于星形膠質細胞和小膠質細胞中的表皮生長因子受體(EGFR)結合，激活EGFR信號通路，從而使受體C端酪氨酸殘基自身磷酸化發揮生物學效應。該信號通路激活有可能起到促炎加重神經元損傷的作用。目前尚未有ALS患者血漿TGF-α水平研究的報道，本研究嘗試通過探討該細胞因子在ALS患者及其不同亞組間血漿水平的變化，探討其在疾病中可能起到的病理作用，為酪氨酸激酶抑制劑等治療ALS的措施提供更多的理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象 (1)患者組：系2010年7月～2014年11月南京腦科醫院門診及住院的48例ALS患者，男26例，女22例，男女比例1.18∶1，年齡37～74歲，平均(54.52±10.20)歲。入組標準：診斷符合國際Escorial 修訂版診斷標準,“臨床確診”及“臨床擬診”的患者[3]。排除標準：入組前2個月服用解熱鎮痛消炎藥、甾體激素及他汀類藥物；已行經皮胃造瘺術；預測用力肺活量<50%；糖尿病患者；有系統性感染的患者。(2)正常對照組：系年齡、性別與患者組匹配的同期57名正常體檢者，男31名，女26名，男女比例1.19∶1，年齡36～72歲，平均(55.67±9.07)歲。該研究獲得南京醫科大學附屬腦科醫院倫理委員批準，倫理號(2010)倫審第(06)號。

1.2 方法

1.2.1 資料收集與分亞組 患者診斷后均進行功能評分(ALSFRS-R評分)[4]，根據評分結果評估疾病的嚴重程度，將患者分為ALSFRSR評分≤24分(重度臨床狀態)和>24分(輕度臨床狀態)兩個亞組[5]。根據起病部位，將患者被分為延髓起病和肢體起病兩個亞組；患者的平均病程19.3個月(2～96個月)，根據病程，將患者分為病程≤12個月和>12個月兩個亞組[5]；根據性別，將患者分為男女兩個亞組。

1.2.2 血漿TGF-α水平的檢測 提取血漿：48例ALS患者于診斷后、57名正常對照者于體檢后分別抽取肘靜脈血1 ml，采用EDTA抗凝。在2～8 ℃下離心機(上海天美科學儀器有限公司CT15RT)1000 r/min離心15 min，離心后取上清，置于EB管。標本采集后30 min內放入冰箱(中國海爾公司)，-80 ℃冷凍保存備用。檢測標本：標本送到Merck Millipore公司上海總部實驗室，用MILLIPLEX MAP 液相芯片試劑盒(產品編號HCYTOMAG-60K)完成血漿TGF-α水平檢測。

2 結 果

2.1 各亞組基本資料 將患者根據性別、年齡、病程、起病部位、功能評分分為若干亞組。病程≤12個月患者26例，平均年齡(55.00±8.89)歲，男14例，女12例;病程>12個月的患者22例，平均年齡(53.95±11.75)歲，男12例，女10例。延髓起病的患者12例，平均年齡(59.33±12.54)歲，男7例，女5例;肢體起病的患者36例，平均年齡(52.92±8.92)歲，男19例，女17例。ALSFRS-R評分>24分的患者37例，平均年齡(53.78±9.52)歲，男20例，女17例;ALSFRS-R評分≤24分的患者11例，平均年齡(57.67±12.04)歲，男性6例，女性6例。

2.2 各組血漿TGF-α水平的比較 ALS組患者血漿TGF-α水平(8.42±7.19)pg/ml，較正常對照組(2.12±0.59)pg/ml明顯升高(P<0.05)。男性患者與女性患者血漿TGF-α水平分別為(8.67±7.53)pg/ml與(8.12±6.93)pg/ml，均較正常對照組明顯升高(均P<0.05)，但男性患者和女性患者間差異無統計學(P>0.05)。年齡≤55歲的患者和年齡>55歲的患者血漿TGF-α水平分別為(8.26±7.01)pg/ml與(8.56±7.49)pg/ml，均較正常對照組明顯升高(均P<0.05)，但年齡≤55歲的患者與年齡>55歲的患者間差異無統計學(P>0.05)。病程≤12個月患者與病程>12個月患者的血漿TGF-α水平分別為(6.13±5.85)pg/ml，(11.12±7.79)pg/ml，均較正常對照組明顯升高(均P<0.05)。而且，病程>12個月患者的血漿TGF-α水平較病程≤12個月的患者明顯升高(P<0.05) 。延髓起病的患者、肢體起病的患者血漿TGF-α水平分別為(8.12±8.24)pg/ml與(8.52±6.93)pg/ml，均較正常對照組明顯升高(均P<0.05)，但延髓起病的患者和肢體起病的患者間差異無統計學(P>0.05)。ALSFRS-R評分≤24分的患者與ALSFRS-R 評分>24分的患者血漿TGF-α水平分別為(12.90±9.67)pg/ml與(7.08±5.79)pg/ml，均較正常對照組明顯升高(均P<0.05)，但ALSFRS-R評分>24分的患者和ALSFRS-R 評分≤24分的患者間差異無統計學意義(P>0.05) 。進一步統計學分析揭示，患者的血漿TGF-α水平與病程統計呈正相關(RRho=0.314，P=0.030) 。

3 討 論

ALS是一種迄今為止發病機制仍不明的疾病，只有大約5%～10%的ALS病例是家族性的，其余病例是散發性的，可能是多種基因變異和復雜環境因素共同作用所致[6-7]。該疾病病理生理機制復雜，炎癥機制可能是其中若干因素之一。研究[8]認為，在該疾病的早期,小膠質細胞處于M2表型，起到抑炎作用，后期隨著病程發展，轉化為M1表型，釋放促炎因子加速疾病的進展。

作為表皮生長因子(EGF)家族的一員，TGF-α是EGFR內源性配體之一，通過與表達于星形膠質細胞和小膠質細胞中的EGF受體結合，使受體C端的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而起到促進細胞生長、轉化的作用。自身磷酸化的EGFR促進小膠質細胞和星形膠質細胞由靜息態向激活態轉變，激活態細胞釋放大量自由氧，導致脂質過氧化、谷氨酸興奮性毒性反應，同時可以釋放大量炎性因子，產生過量的一氧化氮，最終導致神經元死亡[9]。有證據[10]表明，EGFR信號通路在ALS病理生理機制中發揮重要作用。

作為抑制谷氨酸興奮性毒性作用的力如太是1995美國食品藥品管理局(FDA)最早批準用于口服治療ALS的藥物[1]。2016年，在SOD1G93A型ALS突變鼠動物模型的研究中發現，模型鼠出現肢體癱瘓7 d后給予口服高選擇性酪氨酸激酶抑制劑馬賽替尼(Mastinib)30 mg/(kg·d)，最終與對照組比較，能夠延長模型鼠癱瘓后生存期40%。研究[11]發現，高選擇性酪氨酸激酶抑制劑馬賽替尼能抑制異常小膠質細胞的增殖，阻滯小膠質細胞遷移和神經炎癥，歐洲藥物管理局孤兒藥品委員會于2016年8月授予馬賽替尼治療ALS的孤兒藥地位。

本研究發現，患者血漿中激活EGFR信號通路的EGF TGF-α水平明顯高于正常對照組，對患者亞組分析發現，各患者亞組與正常對照相比有明顯統計學差異(均P<0.05)，病程>12個月的比病程≤12個月的血漿TGF-α水平明顯升高(P<0.05)，且指標與病程呈正相關，可以推斷血漿TGF-α在ALS的炎癥機制中起到一定作用，可能隨著病程的增加，血漿TGF-α水平增加，可能使星形膠質細胞和小膠質細胞中EGF受體C端的酪氨酸殘基自身磷酸化作用加強，增強EGFR信號通路的激活，促進疾病進展。不同的起病部位、性別、年齡之間差異無統計學意義，說明該指標與起病部位、性別、年齡無相關性。而且，該指標與疾病嚴重程度之間差異無統計學意義，可能與受試者數量相對較少有關，今后應增加更多的入組病例數。

目前尚未有ALS患者血漿TGF-α水平研究的相關報道，本研究可以推斷血漿TGF-α在ALS炎癥機制中起到一定的作用，并可能起到加速病情進展的作用，該指標可能成為推斷疾病進展的生物標記。本研究可以嘗試為酪氨酸激酶抑制劑治療ALS提供更多的理論依據。目前，以EGFR作為藥物靶點的創新藥物研究，多集中在腫瘤領域[12]，近年針對ALS病理機制的藥物研究層出不窮，本研究可以為今后應用EGFR抑制劑作為ALS治療的藥物靶點邁出嘗試的一步。ALS作為一種罕見病，發病率相對較低，該疾病標本的留取存在一定困難，進一步研究需要更大的群組研究和更多的患者亞組，開展縱向研究，今后將對實驗方案設計作進一步完善。

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