右歸飲對模擬人體內應力環境中成骨細胞堿性磷酸酶分泌的影響

張葆鑫，王興國，郝廷

內蒙古醫科大學第二附屬醫院創傷一科，內蒙古呼和浩特 010000

骨折的愈合、骨量的均衡和生長斗魚力學作用有關系。在對應力作用下，成骨細胞將發揮出主要的效應。傳統的醫學理論認為，骨的生長來自于骨髓中的營養。右歸飲是助陽補腎的基本方，起到促進骨形成的作用[1]。而骨細胞分化成熟的標志是堿性磷酸酶（ALP)的表達，骨細胞功能狀態的良好和骨細胞的分化程度，都可以通過ALP的活性表達來進行反映[2]。該文通過實驗對牽張應力環境下，采用右歸飲含藥血清促進成骨細胞分化增殖的狀況加以論證。

1 材料與方法

①主要儀器包括倒置顯微鏡和顯微拍攝系統、臺式自動平衡離心機、二氧化碳恒溫培養箱、電子天平以及細胞牽拉裝置等。主要試劑為胎牛血清、胰蛋白酶、膠原酶等，堿性磷酸酶活性測定試劑盒、6孔平板細胞培養板均產自美國。②選用的SD大鼠均為雄性，用于血清植被，新生SD大鼠乳鼠為24 h，用于成骨細胞培養。③首先進行血清的制備，右歸飲主要成分為：山茱萸、山藥、枸杞、甘草、杜仲、肉桂、制附子。其次制備無藥和含藥血清。按照右歸飲組和生理鹽水組進行大鼠的分組，每組20只。右歸飲組按照人的日用臨床劑量進行折算，每日灌藥量為20 g/kg，生理鹽水組給予生理鹽水的灌藥量等同于右歸飲組。兩組均進行連續灌胃1周。末次灌胃后2 h，采用常規麻醉心臟取血的方法，將血清分離出來，在-20℃進行保存。骨細胞的培養采用序列酶消化法，將細胞進行等量分組，共分為6組，每組6孔。其次采用10%的水合氯醛腹腔注射液進行麻醉和心臟取血后，采用3 000 r/min進行10 min的離心，取得上層的血清，進行混合均勻后，除菌濾膜，分成4 mL每瓶加以分裝。④對新生24 h的大鼠乳鼠，在頸椎脫臼處死后，使用75%的乙醇進行10 min的浸泡，揭去頭頂的皮膚，切下頭蓋骨，清除骨膜、血管，放置在PBS液內進行兩次的清洗，至發白后剪成小片，尺寸為1 mm×1 mm。然后放置在胰蛋白酶溶液中。清除纖維組織，再移入膠原酶溶液中，最終收集振蕩后的分離細胞。⑤對于分離好的細胞進行無血清培養和同步化培養，分別進行無血清和無血清牽張形變、生理鹽水血清和生理鹽水血清牽張形變的培養基，設置溫度為37℃。培養時間為24 h。對于各組別均施加牽張應力頻率為0.5 Hz,形變量牽張應力條件為常規培養。采用ALP定量測定的方法，公式如下：

對于各組細胞進行CAKP(堿性磷酸酶染色）的處理，經過蘇木素或者甲基綠進行復染液的復染，3 min后在顯微鏡下進行觀察。

2 結果

經過12、24 h的無血清培養基和生理鹽水血清對照組的對比，采用右歸飲血清進行的骨細胞ALP細胞監測結果與生理鹽水組的比較差異有統計學意義（P＜0.05）。無血清對照組和無血清12%牽張形變組的比較差異有統計學意義P＜0.05）。生理鹽水血清12%形變組和含藥12%形變組比較差異有統計學意義。

表1 各組12 h、24 h成骨細胞ALP活性測定結果（±s）

表1 各組12 h、24 h成骨細胞ALP活性測定結果（±s）

組別1 2 h A L P 2 4 h A L P無血清對照組生理鹽水血清對照組右歸飲血清對照組1 2%牽張無血清組1 2%牽張生理鹽水血清組1 2%牽張右歸飲血清組1 0 1.9 5±1 2.3 5 5 5 0.9 5±1.3 5 7 8 7.9 5±1.3 5 8 1.9 5±1.3 5 7 1 1.9 5±4 5.3 5 9 1 3.9 5±1.4 5 9 1.9 5±4.3 5 6 6 8.9 5±1.3 5 9 1 1.9 5±1.3 5 7 9.9 5±1.3 5 9 5 4.9 5±7 1.3 5 1 0 1 1.9 5±3 2.3 5

3 討論

經過對細胞施加應力刺激之后，發現對于成骨細胞進行力學作用的影響是值得研究的[3]。低頻率的牽張應力刺激能夠對骨細胞的增值變化進行促進。12%的牽張形變的應力刺激比6%的牽張形變要大。在試驗中設置了力學加載條件為0.5 Hz，12%的牽張形變量，在此基礎上進行其他各組的骨細胞狀態的觀察，結果顯示，右歸飲含藥血清的培養細胞，在進行牽拉24 h無血清培養基培養后，ALP分泌量比12 h無血清不施加牽拉培養細胞的分泌量要弱。說明，動物體內細胞感應應力刺激的先決條件，與牽張應力有很大的關系。經過試驗，右歸飲能夠促進激素型股骨頭壞死患者受抑制的骨髓間充質細胞火花，并且分化為成骨細胞，形成礦化結節[4]。機械應力刺激包括了骨壓縮、骨組織改建等。右歸飲作用于牽張應力刺激結合起來，需要對成骨細胞增殖分化活性狀態的有效指標進行評價，而采用ALP定量分析和堿性磷酸酶染色的方法，是進行成骨細胞在藥物和物理刺激下產生影響的常用方法，證明右歸飲作用和牽張應力刺激，能夠明顯促進骨細胞ALP分泌和CAKP顆粒形成，對今后的科研和臨床研究具有參考作用。

[1]湯小康,應航,倪哲吉,等.右歸飲對模擬人體內應力環境中成骨細胞堿性磷酸酶分泌的影響[J].北京中醫藥大學學報,2013,36(8):542-545,549,后插2.

[2]陸超鋒,湯小康,程婉,等.模擬人體內應力環境下對比六味地黃湯和右歸飲對成骨細胞增殖分化影響的實驗研究[C]//2013中國(杭州)中醫藥多學科研究國際學術會議論文集.2013:280-285.

[3]黃朋濤,劉景巖,王遵來,等.右歸飲影響SAMP6鼠血清骨重建調控因子的實驗研究[J].世界中西醫結合雜志,2014,9(9):931-933.

[4]夏臣杰,尹利明,黃杰烽,等.右歸飲促異體骨髓細胞向成骨分化防治輻照后骨量丟失機制的實驗研究[J].山西中醫學院學報,2015(4):19-21,24.