檢測方法精密度的表達與確定—以HPLC-MS檢測海洋沉積物中六溴環十二烷方法為例

冉麗紅，郭遠明，孫秀梅，張 帥，陳雪昌

（浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021）

六溴環十二烷（HBCD）是一種高溴含量的脂環族添加阻燃劑，HBCD還被認定是一種持久性有機污染物[1]。具有持久性、遷移性、生物蓄積性、并且可導致血清激素濃度下降，抑制神經遞質正常吸收、引起肝組織病理學改變、且具有致畸、致癌潛力[2-3]。也因此HBCD受到國際社會的廣泛關注[4]，被斯德哥爾摩公約列為POPs之一，在海洋環境監測和海洋生物體質量檢測中也越來越受到關注[5]。目前對國內海洋環境和生物體中HBCD的測定方法有很多種，也有多種評價檢測方法的標準。但是尚未見到用重復性標準偏差、再現性標準偏差、重復性標準差、再現性標準差指標來評價相關檢測方法的文章。因此用這些指標評價檢測方法精密度有很重要的意義。

1 實驗與方法

1.1 檢測方法

海洋環境中HBCD的檢測方法的開發對大洋、近海、河口及咸淡混合水域海洋沉積物中六溴環十二烷的測定具有重要意義。本實驗運用高效液相色譜-串聯質譜法對海洋沉積物中的HBCD進行測定。海洋沉積物中的六溴環十二烷經正己烷提取后，旋蒸濃縮經硅膠固相萃取柱凈化，氮氣吹干用甲醇定容，通過高效液相色譜柱分離，以甲醇、乙腈和水為流動相進行洗脫，用高效液相色譜-串聯質譜法測定α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的含量，內標法定量。除有特殊說明外，試驗所用試劑均為分析純。所用儀器設備有高效液相色譜-串聯四級桿質譜儀，色譜柱（C18柱100 mm×2.1 mm，1.7 μm），或者其他性能相當的色譜柱。硅膠固相萃取柱：6 mL，含1 000 mg硅膠等。沉積物樣品的采集、預處理、制備和保存，按GB 17378.3中5的有關規定執行。實驗步驟按提取、凈化、空白試驗、標準系列溶液的配制以及樣品測定的要求進行。試驗數據處理按GB 17378.2的有關規定執行。

1.2 精密度測試方法

制定一個六溴環十二烷的檢測方法的標準，重要的任務之一就是確定標準測量方法的精密度。通常情況下精密度是表征隨機誤差的大小，用標準差表示。但是這種方法多是針對一個實驗室的數據進行精密度分析時所使用的。但是更好的評價新檢測方法的精密度，需要通過組織試驗室間的協同試驗，用數理統計方法計算并確定標準測試方法的重復性限r和再現性R與質量分數m的函數關系，即方法精密度[6]。精密度數值是測試方法的質量指標，是評價、選擇測試方法和制修訂標準的依據[7]。需要用到重復性標準差、再現性標準差、重復性相對標準偏差以及再現性相對標準偏差這些指標[8]。

本實驗運用高效液相色譜-串聯質譜法對海洋沉積物中的HBCD進行測定。測定數據來自國家海洋局東海環境監測中心、浙江省水產質量檢測中心、舟山出入境檢驗檢疫局、農業部黑龍江流域漁業生態環境監測中心、寧波市漁業環境與產品質量檢驗監測中心、浙江省舟山海洋生態環境監測站和浙江省海洋水產研究所 7 個實驗室。測試濃度有 0.3、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/kg，每個濃度測定 6 次。

2 結果與討論

2.1 實驗結果

各實驗室原始數據。本實驗運用高效液相色譜-串聯質譜法對海洋沉積物中六溴環十二烷進行加標回收。對7個檢測機構的檢測結果進行收集并對檢測結果進行數據處理和精密度分析。原始數據用表1的格式進行表示，以海洋沉積物α-HBCD為例：

表1 海洋沉積物α-HBCD加標回收測得值Tab.1 Marine sediment α-HBCD plus standard recovery measured value μg/kg

2.2 結果計算

標準測試方法以及正在標準化的測試方法或某些非標準測試方法，都應給出測試方法的精密度[9]。精密度是評價分析方法的一個重要指標，它是指使用同一方法，對同一樣品進行多次測定所得測定結果的一致程度。或者說它表示多次測量所得測定結果的一致程度。或者它表示多次測量某一量時的測定值的離散程度。通常用相對標準偏差來量度分析方法的精密度[10]。采用重復性限和再現性限來表示方法的精密度[11]。

2.2.1 單元平均值的計算

單元平均值計算公式：（yi是檢測值，n是檢測值數）

平均值計算結果見表2。

表2 單元平均值Tab.2 Unit average

2.2.2 標準差Sij的計算

標準差計算公式：（yi是檢測值，n是檢測值數yˉ是平均值）

標準差的計算結果見表3。

表3 單元平均值Tab.3 Unit average

2.2.3 總平均值、重復性方差Srj和再現性方差SRj的計算

以上指標的計算公式如下：

計算結果見表4。

表4 總平均值、重復性方差和再現性方差Tab.4 The total average value,the variance of the repeatability and reproducibility of variance

重復性標準差的最小值是0.018；最大值是2.671。

再現性標準差的最小值是0.018；最大值是3.689。

2.2.4 重復性相對標準偏差和再現性相對標準偏差的計算

重復性相對標準偏差=Sr/水平j；

再現性相對標準偏差=SR/水平j；

重復性相對標準偏差和再現性相對標準偏差的計算結果見表5。

表5 重復性相對標準偏差和再現性相對標準偏差Tab.5 Repeatability relative standard deviation and reproducibility relative to standard deviation

重復性相對標準偏差的最小值是0.019；最大值是0.102。

再現性相對標準偏差的最小值是0.019；最大值是0.094。

2.3 結果討論

運用重復性標準差、再現性標準差、重復性標準偏差及再現性標準偏差是目前最優的評價方法精密度的方法。對海洋沉積物中六溴環十二烷加標回收精密度分析，參照以上對海洋沉積物α-HBCD加標回收值進行精確度相關指標的計算，參照國標（GBT 6379.2-2004）測量方法與結果的準確度。對7個實驗室的海洋沉積物中α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD測定結果的重復性標準差、再現性標準差、重復性相對標準偏差、再現性相對標準偏差進行計算。結果見表6。

表6 海洋沉積物中六溴環十二烷測定結果相關指標Tab.6 Correlative indicators of determination of hexabromocyclododecane in marine sediments

對海洋沉積物中六溴環十二烷測定結果分析：

回收率在70%～120%之間，批內相對標準偏差小于15%，批間相對標準偏差小于20%。

根據GB/T 6379.2-2004測量方法與結果的準確度（正確度與精密度）第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法和GB/T 20001.4-2015標準編寫規則第4部分試驗方法標準，結合實驗分析數據，求得方法精密度和準確度。海洋沉積物中α-HBCD的重復性標準差不大于2.67×10-9，重復性相對標準偏差不大于10%；再現性標準差不大于3.68×10-9，再現性相對標準偏差不大于9.4%。海洋沉積物中β-HBCD的重復性標準差不大于2.25×10-9，重復性相對標準偏差不大于4.9%；再現性標準差不大于2.70×10-9，再現性相對標準偏差不大于6.3%。海洋沉積物中γ-HBCD的重復性標準差不大于2.27×10-9，重復性相對標準偏差不大于6.7%；再現性標準差不大于3.00×10-9，再現性相對標準偏差不大于6.4%。

根據GB 17378.2-2007海洋監測規范第2部分：數據處理與分析質量控制，得知分析結果所在數量級10-9的相對偏差容許限為30%[12]。以海洋沉積物中α-HBCD為例：添加量為2 μg/kg時的相對偏差容許限為10.8%；添加量為20 μg/kg時的相對偏差容許限為9.8%；添加量為50 μg/kg時的相對偏差容許限為14.0%；添加量為0.3 μg/kg時的相對偏差容許限為6.8%；添加量為1 μg/kg時的相對偏差容許限為6.9%；添加量為5μg/kg時的相對偏差容許限為3.9%；添加量為0.5 μg/kg時的相對偏差容許限為2.4%；添加量為10 μg/kg時的相對偏差容許限為2.5%。由計算結果可以得知相對偏差在合理范圍內。說明可以運用高效液相色譜-串聯質譜法對海洋沉積物中的六溴環十二烷含量進行測定。而且此方法分離效果好，靈敏度高，能滿足環境樣品和生物樣品的分析要求。

3 結論

由以上結果可以得出，檢測結果的精密度的分析對海洋沉積物中六溴環十二烷含量的高效液相色譜-串聯質譜測定方法進行了很好的驗證。重復性標準差、重復性相對標準偏差、再現性標準差、再現性相對標準偏差等指標精密度分析，對于新檢測方法的驗證有很好的實用性。本計算方法具有很好的參考價值。

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