必特螺旋霉素的工業結晶過程

牛夢旗, 朱家文, 陳 葵, 吳艷陽, 楊生武, 應喜平

(1.華東理工大學化學工程研究所,上海 200237; 2.呼倫貝爾北方藥業有限公司,內蒙古 牙克石 022150)

必特螺旋霉素的工業結晶過程

牛夢旗1, 朱家文1, 陳 葵1, 吳艷陽1, 楊生武2, 應喜平2

(1.華東理工大學化學工程研究所,上海 200237; 2.呼倫貝爾北方藥業有限公司,內蒙古 牙克石 022150)

以未知雜質為考察的著重點,探索了25 ℃下必特螺旋霉素最佳結晶時的pH以及同一pH下溫度對工業結晶的影響。利用高效液相色譜對結晶產品進行檢測,并用外標法對必特螺旋霉素中各部分雜質進行了詳細的分析,通過對比結晶過程有效組分和總未知雜質對螺旋霉素的選擇性系數,在兼顧有效組分含量合格和雜質質量分數最低的前提下,確定最優結晶終點pH為7.5～8.0,最優結晶溫度為25～35 ℃。該方法首次以未知雜質的含量變化來探索必特螺旋霉素結晶的規律,工業上便于實施,有利于指導工業生產。

必特螺旋霉素; 結晶pH; 選擇性系數; 雜質

必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)是一種十六元大環內酯類抗生素,由王以光等[1]采用基因重組技術研制開發的一類新藥,為國內首例具有自主知識產權的大環內酯類抗生素。BT是多種結構類似組分的混合物,與螺旋霉素在體外有相似的抗菌活性,而在體內其藥代動力學行為明顯優于螺旋霉素[2]。

不同于其他抗生素,BT是一種由多組分組成的復合型抗生素。對BT結晶過程的研究已有諸多報道[3-5],而以未知雜質的質量分數變化作為結晶過程考察的重點,還鮮有報道。在BT工業生產中,未知雜質的去除是產品合格的難點。本研究將結晶操作設置在未知雜質析出率較低的pH范圍內,同時兼顧有效組分質量分數和其他雜質的分離,進而達到BT純化目標。25 ℃下,研究反應結晶終點pH對BT有效組分質量分數、總未知雜質質量分數以及各部分雜質質量分數的影響,并比較BT結晶過程中各組分和未知雜質對螺旋霉素的選擇性系數,在確保有效組分合格的前提下,依據總未知雜質質量分數的變化趨勢確定最優結晶pH。同時,本文亦探究了同一pH下溫度對結晶過程中有效組分和雜質的影響。這種以未知雜質為切入點來研究BT結晶的工藝,綜合了由于發酵差異造成的BT發酵液組分質量分數差異對提煉過程的影響,可以有效指導工業生產。

1 材料與方法

1.1 儀器

Water E2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 材料

乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、硫酸、氫氧化鈉、乙酸銨均為分析純;乙腈為色譜純;BT標準品,異戊酰螺旋霉素Ⅲ質量分數為48.1%;乙酰螺旋霉素標準品,效價為927 u/mg。BT反萃取液(BT效價為15 221 u/mL,其中異戊酰螺旋霉素Ⅲ質量分數為30.05%,異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質量分數為50.26%,總酰化螺旋霉素質量分數為86.44%,未知雜質質量分數為8.98%)從溶媒萃取法提取工藝中得到,其初始發酵液由呼倫貝爾北方藥業有限公司提供。

1.3 實驗方法

經溶媒萃取法獲得含有BT的反萃取液,向反萃取液中持續鼓入空氣3 h,以去除溶于其中的微量乙酸丁酯,即得結晶液。滴加堿液中和H+使BT結晶析出,同一溫度下分別控制不同的結晶終點pH,以及同一pH下分別控制不同的結晶溫度。結晶液經抽濾烘干后得BT成品。

采用化學效價法[6-7]測定結晶后母液中BT的質量分數,可由分光光度計測定其吸光值實現。

用高效液相色譜(HPLC)[8-9]對BT結晶產品進行分析,用外標法計算組分質量分數。

2 結果與討論

2.1 BT雜質分類

研究發現,BT中含有10余種螺旋霉素類衍生物[10],圖1所示為BT的液相色譜圖,根據液相色譜出峰原理可知,BT中各組分極性強弱不同,其極性順序為:螺旋霉素Ⅲ>乙酰螺旋霉素Ⅱ>乙酰螺旋霉素Ⅲ>丙酰螺旋霉素Ⅱ>丙酰螺旋霉素Ⅲ>丁酰螺旋霉素Ⅱ>異戊酰螺旋霉素Ⅰ>丁酰螺旋霉素Ⅲ>異戊酰螺旋霉素Ⅱ>異戊酰螺旋霉素Ⅲ。

1—Spiramycin Ⅲ; 2—Acetylspiramycin Ⅱ; 3—Acetylspiramycin Ⅲ; 4—Propionylspiramycin Ⅱ; 5—Propionylspiramycin Ⅲ; 6—Butanoylspiramycin Ⅱ; 7—(iso)Valeryspiramycin Ⅰ; 8—Butanoylspiramycin Ⅲ; 9—(iso)Valeryspiramycin Ⅱ; 10—(iso)Valeryspiramycin Ⅲ

依據各組分極性強弱的不同,將極性大于乙酰螺旋霉素Ⅱ的雜質命名為強極性雜質,將極性在乙酰螺旋霉素Ⅱ與異戊酰螺旋霉素Ⅲ之間的雜質命名為組分間雜質,將極性小于異戊酰螺旋霉素Ⅲ的雜質命名為弱極性雜質。工業生產中BT合格品組分的質量分數為[11]:異戊酰螺旋霉素Ⅲ,w≥30%;異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,w≥60%;總酰化螺旋霉素,w≥80%;螺旋霉素,w≤1%;總未知雜質,w≤5%。

2.2 BT各組分選擇性系數與結晶析出率的關系

2.2.1 化學效價 調節結晶液至某一特定pH,BT在結晶產品和母液中達到反應平衡,反應方程式如下:

(1)

為便于研究,結晶產品中的BT量用化學效價(Chemical Titer)來表示。將結晶液過濾,所得濾餅烘干,即得BT產品,總效價Tp可表示如下:

(2)

其中,cp為BT產品的化學效價,單位為u/mg;m為BT產品的質量,單位為mg。

未結晶水相中BT的總化學效價Ts可表示如下:

(3)

其中,cs為未結晶水相BT的化學效價,單位為u/mL;V為溶液總體積,單位為mL。

以BT中i組分作考察對象,結晶液經過濾后得母液,則i組分在結晶母液中的總效價可表示為:

(4)

其中Tri為i組分在結晶母液中的總效價;Tsi為i組分在未結晶水相中的總效價;Tpi為i組分在結晶產品中的總效價,單位均為u。

2.2.2 分配系數i組分在結晶產品和母液中的分配系數A可表示如下:

(5)

2.2.3 選擇性系數 假設組分1的分配系數為A1,組分2的分配系數為A2,則組分2對組分1的選擇性系數K可表示為:

(6)

式中,Y1為組分1的結晶收率;Y2為組分2的結晶收率,可分別表示如下:

(7)

(8)

式中,wp1、ws1分別為組分1在結晶產品和未結晶水相中的質量分數;wp2、ws2分別為組分2在結晶產品和未結晶水相中的質量分數,利用HPLC分析成品即可得到各個組分的質量分數。

選擇性系數K值越大,則結晶操作對組分2的選擇性越高,對組分1的去除越有利。BT中螺旋霉素的極性大于各有效組分,故以螺旋霉素為基準,在某一pH下,比較各有效組分對螺旋霉素的選擇性系數,可以表征同一pH下各組分結晶析出率的差異。

如圖2所示,隨著分子極性的降低,各組分對螺旋霉素的選擇性系數逐漸增大,說明在螺旋霉素結晶析出率相同的前提下,各組分結晶析出率的大小順序為:異戊酰螺旋霉素Ⅲ>異戊酰螺旋霉素Ⅱ>丁酰螺旋霉素Ⅲ>異戊酰螺旋霉素Ⅰ>丁酰螺旋霉素Ⅱ>丙酰螺旋霉素Ⅲ>丙酰螺旋霉素Ⅱ>乙酰螺旋霉素Ⅲ>乙酰螺旋霉素Ⅱ,且各組分在該結晶pH下均有析出,而析出率的不同最終會影響產品的組分分布。

a—Acetylspiramycin Ⅱ; b—Acetylspiramycin Ⅲ; c—Propionylspiramycin Ⅱ; d—Propionylspiramycin Ⅲ; e—Butanoylspiramycin Ⅱ; f—(iso)Valeryspiramycin Ⅰ; g—Butanoylspiramycin Ⅲ; h—(iso)Valeryspiramycin Ⅱ; i—(iso)Valeryspiramycin Ⅲ

2.3 結晶終點pH對組分分布的影響

2.3.1 結晶液pH及結晶收率的變化 當溫度為25 ℃時,向效價為15 221 u/mL的70 mL BT結晶液中滴加1.0 mol/L的NaOH溶液,結晶液的pH隨NaOH滴加體積的變化如圖3所示,可見在結晶后期pH的變化較為迅速。

圖3 結晶pH隨NaOH體積的變化

BT在過堿條件下,苷鍵及酯鍵均易水解使產物降解[12-13],控制合適的終點pH,可以有效避免因pH過高而使BT失效。圖4所示為產品收率與母液效價隨pH的變化情況,隨著結晶終點pH的提高,母液中BT的量逐漸減少,結晶產品收率與過濾后的母液效價均趨于穩定。當pH=8.2時,結晶收率為88.73%；當pH=8.4時,結晶收率為89.07%,說明結晶液中絕大部分BT已結晶析出。綜合考慮BT在堿性條件下的穩定性和結晶收率,將終點pH控制在低于8.5為宜。

圖4 產品收率及母液效價隨pH的變化

2.3.2 選擇性系數和組分質量分數隨pH的變化 圖5所示為有效組分和總未知雜質對螺旋霉素的選擇性系數隨終點pH的變化,隨著終點pH的升高,異戊酰螺旋霉素Ⅲ、異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總和、總酰化螺旋霉素的選擇性系數先增加后逐漸降低,在pH為7.5～8.0時達到最大值,而在此范圍內,總未知雜質的選擇性系數有一最小值,因此將結晶終點pH控制在這一范圍內是合適的。

圖6所示為BT成品中有效組分質量分數隨結晶終點pH的變化。由圖可見,隨著結晶終點pH的升高,異戊酰螺旋霉素Ⅲ質量分數及異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質量分數均呈現下降的趨勢,而總酰化螺旋霉素質量分數則趨于平穩。當pH>8.0時,異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質量分數低于60%,未達到合格標準。由前述可知,有效組分異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ極性均偏弱,在同一結晶pH下,弱極性組分異戊酰螺旋霉素Ⅲ的結晶析出率最大,異戊酰螺旋霉素Ⅱ和異戊酰螺旋霉素Ⅰ次之,隨著pH的升高,強極性組分的析出率逐漸增大,使異戊酰螺旋霉素Ⅲ質量分數和異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質量分數隨結晶pH的升高而降低。有效組分極性在強、弱極性范圍內均有分布,故總酰化螺旋霉素質量分數隨pH的增加呈波動狀態。

圖5 不同終點pH下各組分的選擇性系數變化

圖6 有效組分質量分數隨終點pH的變化

圖7所示為總未知雜質和各部分雜質質量分數隨結晶終點pH的變化,由圖可知,總未知雜質質量分數先減小后增大,當結晶終點pH為7.5～8.0,總未知雜質質量分數低于5%,達到了合格的標準。強極性雜質、組分間雜質以及弱極性雜質質量分數隨pH的變化趨勢有所不同,強極性雜質質量分數隨終點pH的增大而逐漸增大,組分間雜質質量分數先減小后增大,而弱極性雜質質量分數則逐漸減小。當pH=7.2時,未知雜質質量分數為7.07%,此時弱極性雜質質量分數為1.54%,組分間雜質質量分數為4.13%。然而,過于增大結晶終點pH,只能使強極性雜質大量析出結晶,亦在一定程度上增加了未知雜質的質量分數,降低產品品質。如圖7,當pH=8.4時,未知雜質質量分數為6.02%,強極性雜質質量分數為2.38%,而此時組分間雜質質量分數為3.10%,這說明過高或過低的pH均能使組分間雜質質量分數變大,合適的結晶pH能合理均衡雜質和有效組分的比例。

圖7 未知雜質隨結晶終點pH的變化

2.4 結晶溫度對組分分布的影響

向濃度為15 221 u/mL的70 mL BT結晶液中滴加1.0 mol/L的NaOH溶液,分別在20,30,40,50,60 ℃下進行結晶操作,控制BT結晶終點pH為7.75。圖8所示為有效組分和總未知雜質對螺旋霉素的選擇性系數隨溫度的變化。隨著結晶溫度的升高,異戊酰螺旋霉素Ⅲ、異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總和、總酰化螺旋霉素的選擇性系數先增加后降低,而在25～35 ℃范圍內,總未知雜質的選擇性系數有一最小值。

圖8 不同溫度下各組分的選擇性系數變化

BT在水溶液中的溶解度具有隨溫度升高而降低的負溶解特性[3],因此,控制相同的結晶終點pH,升高溫度可以使更多的BT從水相中結晶出來。圖9所示為BT成品中有效組分的質量分數隨結晶溫度的變化,圖10所示為總未知雜質和各部分雜質質量分數隨結晶溫度的變化。可以推測,極性不同的組分其結晶析出率受溫度影響較大,弱極性組分在低溫下的結晶析出率較大,隨著溫度的升高,強極性組分析出率逐漸增大,有效組分和雜質含量呈現如圖9、10所示的變化趨勢。綜合考慮BT成品中組分分布,將結晶溫度控制在25～35 ℃。

圖10 未知雜質質量分數隨溫度的變化

3 優化工藝與傳統工藝對比分析

傳統工藝以效價和結晶回收率決定結晶終點pH,pH控制在8.2～8.5。優化工藝基于BT組分分布特點決定結晶終點pH,pH控制在7.5～8.0。

為進一步說明優化工藝可行,進行3批驗證實驗。25 ℃下,分別控制結晶終點pH為8.2～8.5和7.5～8.0,將結晶抽濾烘干,用HPLC法分析BT成品中有效組分、螺旋霉素以及未知雜質的質量分數并列于表1。由表可見,與傳統工藝相比,優化工藝將結晶終點pH控制在7.5～8.0,異戊酰螺旋霉素Ⅲ、異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ總質量分數明顯提高,螺旋霉素、未知雜質質量分數明顯降低,優化工藝中的第2批和第3批的BT成品均達到了合格的標準,表明將結晶終點pH控制在7.5～8.0可有效提高BT成品的合格率。

表1 優化工藝與傳統工藝結果比較

4 結 論

結晶過程是工業生產中分離純化BT很重要的一部分,雜質的質量分數是決定產品能否合格的關鍵因素。利用高效液相色譜對成品進行梯度洗脫,在保證有效組分合格和未知雜質質量分數盡可能低的前提下,確定最優結晶終點pH。本研究結果表明,當結晶終點pH控制在7.5～8.0,結晶溫度為25～35 ℃時,可以使雜質質量分數達到最小,從而優化產品質量,指導工業生產。驗證實驗表明,25 ℃下,將pH控制在7.5～8.0可有效提高異戊酰螺旋霉素Ⅲ的質量分數和異戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的總質量分數,降低螺旋霉素和總未知雜質的質量分數,提高BT成品的合格率。

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Crystallization Process of Bitespiramycin

NIU Meng-qi1, ZHU Jia-wen1, CHEN Kui1, WU Yan-yang1, YANG Sheng-wu2, YING Xi-ping2

(1.Chemical Engineering Research Center,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237,China; 2.Hulun Buir North Pharmaceutical Co. Ltd,Yakeshi 022150, Inner Mongolia,China)

Taking unknown impurities as the focal point,the optimum crystallization pH value was investigated at 25 ℃.The effect of temperature on crystallization process was explored at a certain pH value.Gradient elution was utilized to analyze components and impurities in product.Selectivity coefficients of effective components and total unknown impurities to spiramycin were compared with each other.In view of qualified effective compositions and lower impurities contents,the most suitable terminal pH value of crystallization operation was 7.5-8.0,temperature was 25-35 ℃.The variation of unknown impurities contents was first adopted to explore bitespiramycin crystallization in the existing studies,which would have a profound guiding significance for the practical production.

bitespiramycin; crystallization pH value; selectivity coefficient; impurities

1006-3080(2017)01-0023-06

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.01.004

2016-05-18

上海市科委生物醫藥科技重點項目(10431901500)

牛夢旗(1989-),女,山東菏澤人,碩士生,主要從事抗生素分離純化的研究。E-mail:niu1259900193@163.com

陳 葵,E-mail:chenkui@ecust.edu.cn

TQ460.6+3

A