PCR技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用

羅達龍，黃 琳

（梧州食品藥品檢驗所，廣西 梧州 543002）

PCR技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用

羅達龍，黃 琳

（梧州食品藥品檢驗所，廣西 梧州 543002）

中藥作為我國的傳統(tǒng)藥物，千百年來，在預(yù)防與治療疾病方面發(fā)揮了不可替代的作用。但即便是同一種中藥材，在不同的產(chǎn)地、不同的生長模式等方面下都會表現(xiàn)出質(zhì)量以及藥效的差異，而它們的性狀也許只有微乎其微的差別，這就為中藥材鑒別方法帶來了新的挑戰(zhàn)。本文僅對各種基于PCR技術(shù)的分子生物技術(shù)在中藥材鑒定中的應(yīng)用作一綜述

PCR技術(shù)；中藥鑒定；分子生物技術(shù)

1 PCR技術(shù)概述

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，PCR技術(shù)的最大特點是能夠?qū)⑽⒘緿NA有效增加，無論是應(yīng)用于古生物化石、歷史人物殘骸，還是應(yīng)用于中藥材中，只要能夠從中分離出一點DNA，便能利用PCR技術(shù)對分離出DNA增大，從而用于比對。

2 基于PCR技術(shù)的分子生物鑒定技術(shù)

2.1 PCR-RFLP技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性技術(shù)（PCRRFLP），不僅可以實現(xiàn)種屬的鑒別，還能根據(jù)藥材的市場特性，進行摻偽程度的半定量檢測。張文娟等人[1]的研究中，為避免不法分子將偽品混入到川貝母中，運用PCRRFLP技術(shù)探索出檢測川貝母樣品中摻偽比例的半定量方法。他們從川貝母粉中提取DNA，按照體積比，加入不同比例的偽品DNA作為模板使用，運用PCR-RFLP技術(shù)，并在凝膠電泳后通過軟件分析條帶強弱來計算摻偽量，從而直觀地了解中藥中摻假、摻偽的大概比例。

2.2 RAPD或AP-PCR技術(shù)

RAPD與AP-PCR是同時發(fā)展起來的DNA分子標記技術(shù)，其中，RAPD技術(shù)是一種對整個未知序列基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)用隨機引物擴增尋找到的多態(tài)性DNA片段作為分子標記，具有操作簡單快捷、靈敏、通用性好等特點，能夠準確檢測出RFLP標記不能檢測的重復(fù)順序，填補RFLP的圖譜空缺。將RAPD技術(shù)應(yīng)用于中藥鑒定中，其主要是對中藥生藥材（如動物類生藥材、名貴生藥材等）進行代用品、混淆品的鑒定。但RAPD技術(shù)的重復(fù)性和穩(wěn)定性差，使其在應(yīng)用上也受到了限制[2]。為了克服隨機擴增多態(tài)DNA技術(shù)的缺點，有研究采取了提取高質(zhì)量的基因組DNA，并對RAPD反應(yīng)的條件進行了優(yōu)化等措施，來保證其穩(wěn)定性。通過對湖北麥冬、川麥冬及浙麥冬三種藥用麥冬基因組DNA的RAPD分析，篩選出三種麥冬的特異性分子鑒定標記，經(jīng)過對特異性標記的克隆和測序，最后設(shè)計出三種麥冬的特異性PCR引物，實現(xiàn)了特異性鑒定。

2.3 位點特異性PCR

位點特異性PCR技術(shù)又稱作擴增阻滯突變系統(tǒng)，位點特異性PCR是一種基于SNP位點的基因分型方法，即通過單個PCR反應(yīng)即可達到真?zhèn)舞b別的目的，具有操作簡單、快速的特點，非常有利于中藥材的鑒別。黎潔文[3]通過對何首烏、何首烏近緣種和混淆品ITS2序列的變異分析，尋找具有穩(wěn)定差異的變異位點，設(shè)計特異性引物，確定PCR反應(yīng)條件，采用平板凝膠電泳并創(chuàng)新地使用毛細管凝膠電泳檢測特異性PCR擴增產(chǎn)物，建立何首烏位點特異性PCR分子鑒別方法。

2.4 ISSR技術(shù)

ISSR技術(shù)又被稱之為錨定簡單序列重復(fù)技術(shù)，具有重復(fù)性好、多態(tài)性高等特點，屬于近幾年來發(fā)展起來的一類新型的分子標記技術(shù)，在中藥材鑒定方面得到廣泛的應(yīng)用。ISSR技術(shù)用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在PCR技術(shù)中，錨定引物可以引起特定位點退火，從而使與錨定引物互補間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進行PCR擴增。例如，采用ISSR技術(shù)鑒別雞血藤及其混偽品，通過篩選出5條ISSR隨機引物，對廣西產(chǎn)雞血藤與其混偽品進行擴增，擴增出的DNA指紋圖譜之間有明顯差異，可見ISSR技術(shù)可作為鑒別廣西產(chǎn)雞血藤與其混偽品的有效手段，為廣西產(chǎn)雞血藤提供了分子水平的鑒別依據(jù)。并通過實驗發(fā)現(xiàn)在檢測出的遺傳變異靈敏度上ISSR技術(shù)高于RAPD技術(shù)，ISSR技術(shù)更適用于廣西產(chǎn)不同居群雞血藤的遺傳多樣性分析。

3 PCR技術(shù)鑒定方法的不足

（1）一些中藥材可能存在次生代謝產(chǎn)物影響DNA提取，或者經(jīng)過炮制的中藥材會對DNA提取造成干擾；（2）分子生物看不見摸不著，使得在做方法可行性試驗時需進行大量的實驗來摸索與優(yōu)化，并需要較強的專業(yè)技術(shù)能力；（3）中藥材種植方法、產(chǎn)地、栽培變異等因素不同，影響每種標記方法的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性，實際應(yīng)用時需要大量樣品來驗證；（4）藥鑒定的發(fā)展趨勢是尋找高效、便捷、準確的鑒定方法，但一般的分子標記鑒別方法仍需經(jīng)過藥材DNA的提取、PCR擴增、電泳檢測三個步驟，時間還是長于其他鑒別方法。

4 展 望

科技日新月異的發(fā)展，分子生物學(xué)更是以其可變性強、研究方向多樣、適用范圍廣等優(yōu)勢，在藥品檢驗的領(lǐng)域上開始高速地發(fā)展，很多基于PCR的先進技術(shù)已經(jīng)開始進入到中藥材的鑒別中。當然，我們還需要致力于解決文中提到的不足之處，讓PCR技術(shù)能成為快速、準確、穩(wěn)定的藥品檢定技術(shù)。

[1] 張文娟,魏 鋒.PCR-RFLP法用于半定量檢測川貝母摻偽的研究[C].南京:中國藥學(xué)會藥物分析專業(yè)委員會,2013/10:331-334.

[2] 徐 紅,王崢濤,胡之璧,等.中藥DNA分子鑒定技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2003,5(2):24-30.

[3] 黎潔文.基于ITS2序列分析的何首烏PCR-RFLP和AS-PCR的分子鑒別研究[D].廣東:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2015.

本文編輯：趙小龍

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ISSN.2095-8242.2017.24.4731.01