循環(huán)腫瘤細(xì)胞在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用及展望

吳劍龍，曹明溶?

（1.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510630；2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510630）

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用及展望

吳劍龍1，曹明溶2?

（1.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510630；2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510630）

原發(fā)性肝癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，侵襲、轉(zhuǎn)移力強(qiáng)，死亡率高，且預(yù)后較差。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）是指實(shí)體瘤或者轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞脫落并釋放入外周血液循環(huán)當(dāng)中的腫瘤細(xì)胞，它與患者治療后的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的到來(lái)及細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)促進(jìn)了乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤的診斷、病情管理、治療及預(yù)后評(píng)估。現(xiàn)筆者就近年來(lái)關(guān)于 CTCs 在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用及前景進(jìn)行綜述。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；原發(fā)性肝癌；治療應(yīng)用

原發(fā)性肝癌（肝癌）在當(dāng)前全球男性腫瘤中發(fā)病率位居第五位，女性中居第七位[1]。盡管如此，絕大多數(shù)肝癌患者仍然出現(xiàn)在非西方國(guó)家，據(jù)2012年統(tǒng)計(jì)，中國(guó)肝癌新發(fā)率已占全球50%以上。原發(fā)性肝癌在全球癌癥致死病因中高居第二位，全世界平均每年約有25萬(wàn)人死于肝癌，而我國(guó)約占總數(shù)的45%，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命和健康[2]。近年來(lái)隨著檢驗(yàn)技術(shù)及診斷方式的進(jìn)步，肝癌的檢出率有所上升，死亡率有所下降，但大部分患者確診時(shí)已是晚期、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，此時(shí)往往已經(jīng)失去治療的“黃金”時(shí)期。為了進(jìn)一步優(yōu)化對(duì)原發(fā)性肝癌的診療，高效的、準(zhǔn)確預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的和評(píng)估預(yù)后效果的檢測(cè)指標(biāo)具有很重要的價(jià)值。循環(huán)腫瘤細(xì)胞最早在1869年由Thomas Ashworth發(fā)現(xiàn)[3]，小量存在于癌癥患者血液中類似于原發(fā)腫瘤的細(xì)胞，是一種監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及觀察腫瘤異質(zhì)性的標(biāo)志物，與轉(zhuǎn)移性癌癥患者的無(wú)進(jìn)展生存期率、總生存率、監(jiān)測(cè)治療效果以及制定個(gè)體化治療方案密切相關(guān)。目前，CTCs被FDA證實(shí)在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等預(yù)后提供有效依據(jù)[4]，但在肝細(xì)胞癌（HCC）的臨床應(yīng)用是滯后于這些腫瘤類型。為此本文總結(jié)CTCs的檢測(cè)并探討其在肝癌的臨床意義及前景。

1 HCC-CTCs的富集與檢測(cè)

CTCs是由原發(fā)或轉(zhuǎn)移癌灶中脫落并釋放至外周血液循環(huán)。在外周血液中，CTCs的含量極少，通常1毫升癌癥患者外周血中約含有1000萬(wàn)的白血細(xì)胞和50億的紅血細(xì)胞，其中僅含有1個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞[5]。高靈敏度和高特異度的分離富集和鑒定技術(shù)成為CTCs檢測(cè)重要體系。

CTCs的富集技術(shù)是根據(jù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的物理學(xué)（大小、密度、電荷及變性能力）和生物學(xué)（細(xì)胞表面蛋白表達(dá)、活性）特征，從外周血細(xì)胞中提高CTCs的相對(duì)濃度[6]。目前，常用的富集方法包括：1.密度梯度離心法 是最經(jīng)典的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離技術(shù)之一，通過(guò)血液細(xì)胞密度的差異，在離心力的作用下，導(dǎo)致不同類型的細(xì)胞分離至不同的層面。質(zhì)量較輕的腫瘤細(xì)胞和單核細(xì)胞保留在離心液的上層，而質(zhì)量較重的紅細(xì)胞和嗜中性粒等細(xì)胞則遷移至底部。在此機(jī)制上，建立了傳統(tǒng)的ficoll-hypaque和德國(guó)的oncoquick法。使用ficoll-hypaque或oncoquick方法在原發(fā)性肝癌中進(jìn)行了CTCs的密度梯度分離，以將CTCs與其他血細(xì)胞分離。相對(duì)于ficoll-hypaque法，oncoquick法能有效的避免了不同細(xì)胞層間的交叉污染[7-8]。2.濾過(guò)法 根據(jù)細(xì)胞的大小，使用特定的過(guò)濾器，將目的細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。CTCs可以很容易的從外周血中通過(guò)聚碳酸酯孔膜中分離出來(lái)。這種技術(shù)溫和，不會(huì)造成細(xì)胞的損傷，有效地提高分析效能[9]。然而濾過(guò)法具有相對(duì)較低的靈敏度和特異性，小CTCs可能丟失，而大的白細(xì)胞可能影響CTCs的檢測(cè)。3.免疫磁性分離法是目前臨床及科研應(yīng)用最廣泛及唯一通過(guò)FDA批準(zhǔn)的分離技術(shù)，原理為：CTCs表面表達(dá)的特異性抗原，與磁珠包被的同源抗體結(jié)合，制成免疫磁珠，形成“腫瘤細(xì)胞-抗原抗體-磁珠”復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)的作用下，進(jìn)一步分離和富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞[9]。目前，根據(jù)磁性細(xì)胞分選策略的不同，大致分為: 陽(yáng)性富集法和陰性富集法。在陽(yáng)性富集法中，直接與腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原結(jié)合（如EpCAM、CK-19）捕獲CTCs，缺乏明確的腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原是這方法的主要局限性。陰性富集法中通過(guò)靶向性結(jié)合白細(xì)胞共同表達(dá)的抗原（如CD45）去除血液中大部分白細(xì)胞，從而獲得CTCs，這種方法由于與非特異性的抗原結(jié)合，可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性[10]。

成功富集CTCs后，第二步就是準(zhǔn)確識(shí)別來(lái)自外周血細(xì)胞中的腫瘤細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，CTCs主要檢測(cè)方法可分為兩組：基于流式細(xì)胞儀和以核酸為基礎(chǔ)的方法[11]。基于流式細(xì)胞儀技術(shù)使用免疫細(xì)胞化學(xué)法來(lái)分析不同的腫瘤細(xì)胞；以核酸為基礎(chǔ)的技術(shù)使用PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量的RT-PCR、全基因擴(kuò)增和熒光原位雜交技術(shù)（FISH技術(shù)）檢測(cè)外周血液中的細(xì)胞DNA或RNA序列，進(jìn)一步區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常血細(xì)胞。①免疫細(xì)胞化學(xué)法（Immunocytochemistry，ICC）通過(guò)使用標(biāo)記（如熒光分子）的特異性抗體與腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原結(jié)合，形成可視化的復(fù)合物，完成對(duì)腫瘤細(xì)胞的測(cè)定。ICC的優(yōu)點(diǎn)對(duì)腫瘤細(xì)胞大小和形態(tài)學(xué)的分析，缺點(diǎn)是耗時(shí)及敏感性低[12]。②RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，是目前以核酸為基礎(chǔ)的應(yīng)用最廣泛、最有效的方法，主要檢測(cè)來(lái)自CTCs的DNA或mRNA，具有高靈敏度、可循環(huán)使用的優(yōu)點(diǎn)，但由于檢測(cè)的是核酸，測(cè)定過(guò)程中需要破壞CTCs，因而無(wú)法統(tǒng)計(jì)腫瘤細(xì)胞數(shù)目及分析腫瘤細(xì)胞的形態(tài)[13]。

2 CTCs在原發(fā)性肝癌的應(yīng)用

2.1 CTCs檢測(cè)在肝癌輔助診斷及預(yù)后方面的價(jià)值

血行轉(zhuǎn)移是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式。目前，肝癌轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠影像學(xué)和血清AFP的監(jiān)測(cè)。臨床上應(yīng)用超聲、CT和MRI對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)只能到1厘米或更大。CTCs的檢測(cè)有助于發(fā)現(xiàn)直徑小于1 mm的腫瘤，對(duì)評(píng)估腫瘤的擴(kuò)散，預(yù)后和治療提供可靠的幫助。

Junhua[14]等使用巢式RT-PCR技術(shù)對(duì)72例肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行術(shù)前、術(shù)后0、3、6、9和12個(gè)月外周血CTCs表達(dá)情況進(jìn)行研究，在肝癌切除術(shù)前，43例患者外周血中CTCs表達(dá)陽(yáng)性，其中有22例在術(shù)后復(fù)查期間已發(fā)生肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移。此外，29例術(shù)前CTCs陰性表達(dá)中，有2例分別在術(shù)后6和9個(gè)月復(fù)查時(shí)CTCs表達(dá)陽(yáng)性且在術(shù)后12個(gè)月發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，證實(shí)了CTCs表達(dá)陽(yáng)性可作為肝癌切除術(shù)后發(fā)生肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵預(yù)測(cè)因子。同時(shí)，Schulze[15]等借助CellSerch平臺(tái)對(duì)59例HCC患者進(jìn)行檢查及生存時(shí)間的分析，結(jié)果顯示30.5%患者CTCs表達(dá)陽(yáng)性，且檢測(cè)出的數(shù)目與BCLC分期呈正相關(guān)，與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，預(yù)示著原發(fā)性肝癌的預(yù)后不良，且CTCs數(shù)目與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。有課題組研究顯示肝癌切除術(shù)前外周血中CTCs數(shù)＞2個(gè)/7.5 mL，則預(yù)測(cè)術(shù)后HCC患者的腫瘤復(fù)發(fā)，特別是在AFP水平＜400 ng/mL或低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者中[16-17]。這些研究結(jié)果均表明CTCs可作為一種新型的肝癌轉(zhuǎn)移診斷指標(biāo)，輔助臨床醫(yī)生對(duì)肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診治。

2.2 CTCs在肝癌臨床療效的相關(guān)性

目前研究證明，肝癌患者在行手術(shù)治療前已有CTCs進(jìn)入血液循環(huán)，通過(guò)自身的免疫逃逸、癌基因與抑癌基因相互作用等因素以休眠狀態(tài)潛伏于患者體內(nèi)，在某些因素的刺激下，它們被喚醒進(jìn)入增殖，分散地存在并播散至機(jī)體的其他部位或組織，從而引起肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移或肝內(nèi)復(fù)發(fā)[18]。當(dāng)轉(zhuǎn)移病灶不能被當(dāng)前影像學(xué)檢查或檢測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)到時(shí)，臨床醫(yī)生沒(méi)有一個(gè)明確的指標(biāo)來(lái)指導(dǎo)這一時(shí)期的診治，這可能錯(cuò)過(guò)癌灶治療的關(guān)鍵時(shí)段。因此，CTCs在外周血中的表達(dá)，即使是很小的病灶（＜1 mm）或者在腫瘤尚未在體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移灶時(shí)，可作為此時(shí)期的一個(gè)新靶點(diǎn)，降低腫瘤轉(zhuǎn)移和手術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，從而提高患者的生存率。AFP是目前HCC診斷及判斷預(yù)后效果最常用的指標(biāo)，但對(duì)于那些低AFP水平甚至假陽(yáng)性的患者，CTCs的監(jiān)測(cè)對(duì)于HCC的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)則更具指導(dǎo)意義。

3 展 望

原發(fā)性肝癌是全球最致命的腫瘤之一。過(guò)去幾年中，隨著診斷和治療方式的進(jìn)步，原發(fā)性肝癌患者預(yù)后已經(jīng)大大改善。但由于檢測(cè)技術(shù)精準(zhǔn)度的局限性，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者總體預(yù)后仍然不佳，因此CTCs可作為新型監(jiān)測(cè)腫瘤標(biāo)記物。CTCs在外周血的存在是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步，它是評(píng)估腫瘤狀態(tài)及預(yù)后一個(gè)重要生物學(xué)標(biāo)志，在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的早期診斷、個(gè)性化治療方案、預(yù)后評(píng)估及預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理等方面具有積極的意義。由于CTCs無(wú)創(chuàng)診斷，可以在治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)患者全身情況，患者依從性較好，因此該技術(shù)逐漸推廣應(yīng)用于臨床工作。但CTCs檢測(cè)成本昂貴、無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法、釋放入血中的規(guī)律性及在肝癌方面的研究相對(duì)較少等問(wèn)題，期望臨床醫(yī)生和研究人員可以更深入地探索CTCs相關(guān)檢測(cè)的技術(shù)及在HCC中的應(yīng)用，旨在改善患者預(yù)后，延長(zhǎng)患者的生存期，更好地應(yīng)用于臨床腫瘤的診治。

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R735.7

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ISSN.2095-8242.2017.066.13052.03

吳劍龍（1991-），男，廣東中山人，在讀碩士研究生，研究方向：普通外科學(xué)

曹明溶，男，教授，碩士，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：tcaomr@jnu.edu.cn

吳玲麗