基于SRAP標記的白鶴芋屬資源鑒定與親緣關系分析

劉小飛，廖飛雄，李冬梅，劉曉榮

（1.廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.華南農業大學林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642）

白鶴芋屬植物原產中南美洲和東南亞［1］，是國際上重要的天南星科室內觀葉觀花植物［2］，具有獨特的開花特性。目前有關白鶴芋屬的研究主要集中在組織培養、栽培技術、種子萌芽特性、開花習性等方面［3-4］。有關白鶴芋屬植物種質、系統演化和遺傳等方面研究報道并不多，而且市場上白鶴芋屬大多數品種名稱較混亂，難以從傳統分類的表型特征、譜系或地理來源等信息對其進行分類。

序列擴增多態性（Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP）是一種基于PCR的分子標記技術，自建立以來已應用于種質資源的鑒定評價、遺傳多樣性與系統發育分析、品種指紋圖譜繪制等方面［5-10］。目前還未見有關白鶴芋屬SRAP標記相關方面的研究報道。本研究在建立和優化白掌SRAP反應體系的基礎上，通過SRAP標記對 23個白鶴芋屬樣品進行分析，以期從分子水平揭示其親緣關系，為白鶴芋屬資源的有效利用和保護提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料白鶴芋屬23個樣品包括21個栽培品種和2個原生種（表1），于2013年4月中旬采自廣東省農業科學院白云基地環境園藝研究所資源圃。采集供試材料的幼嫩葉片，用冰盒保存帶回實驗室。

1.2 試驗方法

采用Liu等［11］改良的CTAB-氯仿-異戊醇法，單株取嫩葉提取基因組DNA。引物、PCR反應體系和反應程序參照劉小飛等［12］，上游引物有me1～me5，下游引物有em1～em6，共30個引物組合；反應程序中72℃延伸時間改為100 s，其他參數不變。指紋圖譜構建及聚類分析參照劉小飛等［12］。主坐標分析采用Nei遺傳距離［13］。

表 1 供試白鶴芋屬材料

2 結果與分析

2.1 SRAP擴增產物的多態性分析

30個SRAP引物組合共擴增出343個位點，其中多態性位點為214個，多態性比率達62%，平均每個引物組合擴增出多態性條帶7.1條，其中多態性較好的有19個引物組合（表2），部分引物擴增電泳結果見圖1。

圖1 引物Me5/Em4對23份白鶴芋屬種質的擴增結果

表2 30個引物組合在23個白鶴芋屬種質中的多態性擴增結果

2.2 基于SRAP標記的聚類分析

從表3可以看出，23份白鶴芋屬種質兩兩之間的遺傳相似系數分布在0.36～0.98之間。其中mo和S. cannifolium的相似系數最小、為0.36，表明兩個種質間的親緣關系最遠；甜糕和綠怡1號之間的相似系數最大、為0.98，表明兩個種質間的親緣關系最近。

從聚類結果（圖2）可以看出，以相似系數0.72為標準，23份白鶴芋屬種質可分為 3類7組。第Ⅰ、Ⅱ類主要是花序具有乳頭狀突起的種質。以相似系數0.84為標準，第Ⅰ、Ⅱ類可以進一步分組，第Ⅰ類只有1份種質，這個種具有與其他白鶴芋屬植物差別明顯的性狀和生長特性，植株緊湊，葉片帶黃綠、具鵝絨質感，白色脈顯著，側脈白色。這些性狀的開發將大大豐富白鶴芋屬植物的觀賞性狀從而提高其觀賞價值。第Ⅱ類分為5組：第 1 組包括S.‘Coddy color’和S.‘Parrish’等15份種質，這組種質花序多具有乳頭狀突起；第 2 組含亮葉1份種質；第 3 組含香水1份種質；第 4組含mo和皇后2份種質；第5組為華麗1號和華麗2號，株型較大。第Ⅲ類有1份種質，為原生種S.cannifolium，花序不具有乳頭狀突起，雌蕊發育不完全，具香味。

圖2 23份白鶴芋屬種質SRAP擴增譜帶的UPGMA聚類結果

2.3 利用主坐標分析的白鶴芋屬23份種質親緣關系

采用主坐標分析對23份白鶴芋屬種質SRAP標記的原始矩陣進行解析，結果表明，前3個主坐標可以闡明的相關性分別為16.8%、8.7%和 5.8%。

進一步通過第一、第二主坐標二維圖對

23份種質排序，以及通過前3個主坐標三維圖對其進行排序，結果見圖3和圖4。 由圖3可知，23份白鶴芋屬種質可分為4類。第Ⅰ類共有19份，該組的花序多具有明顯的乳頭狀突起的種質；第Ⅱ類僅為S. floribundum1份種質，該種質花序乳頭狀突起不明顯；第Ⅲ類僅有S.cannifolium1份種質，該組花序的乳頭狀突起不明顯，且雌蕊與雄蕊近等高；第Ⅳ類有2份種質。

表3 23份白鶴芋屬種質相似性矩陣

圖3 23份白鶴芋屬種質SRAP標記主坐標分析第一、第二主坐標散點圖

在圖3分類基礎上，對其第三主坐標分析，結果（圖4）發現，23份白鶴芋屬種質可進一步分為5組：第Ⅰ類12份種質，第Ⅱ類7份種質，第Ⅲ類和第Ⅳ類均僅有1份種質，第Ⅴ類2份種質歸為1組。

圖4 23份白鶴芋屬種質SRAP標記主坐標分析的三維散點圖

比較分析圖2～圖4表明，系統聚類和主坐標分析所得結果相近，但主坐標分析可以更加直觀地顯示各種質間的關系，分析結果更清晰。

3 討論

SRAP標記技術已廣泛應用于多種園藝植物［14］。本試驗所選用的30對引物可以較好地對23份白鶴芋屬種質進行聚類分析，表明該方法適用于白鶴芋屬種質資源鑒評及親緣關系分析。系統聚類分析可以對親緣關系較近的種質進行分析，而對親緣關系較遠的種質分析效果不理想，主坐標分析方法可有效解決該問題。Renganayaki等［15］和 Sun 等［16］分別在對牧草和春小麥的研究中應用該方法進行數據分析，發現主坐標分析在分析主要類群間關系時可以提供充足信息。本研究中，將兩者結合起來可以更好、更全面地闡明白鶴芋屬23個種質間的親緣關系，為后續的遺傳育種提供相關理論基礎。此外，應用SRAP分子標記分析構建白鶴芋屬植物的指紋圖譜，可以有效解決市場上白鶴芋屬種質命名上的混亂現狀，從而更好地指導科研和生產。

［1］李恒. 中國植物志［M］. 北京：科學出版社，1979.

［2］廖飛雄，柯宣東，于波，等. 觀葉植物白掌產業化生產現狀與發展對策［J］. 廣東園藝，2011，12（4）：16-18.

［3］詹啟成，王奎，蔣雄輝，等. 白鶴芋種子萌芽特性研究［J］. 北方園藝，2012（1）：106-107.

［4］戴樺均，徐維杰，廖飛雄. 白鶴芋屬植物開花特性的觀察∥中國觀賞園藝研究進展［C］.2012：139-144.

［5］趙光偉，徐志紅，徐永陽. SRAP分子標記及其在蔬菜作物上的應用［J］. 中國農學通報，2008，24（8）：69-73.

［6］李建軍，劉志堅，肖層林，等. SRAP技術在遺傳的研究進展［J］. 現代生物醫學進展，2007，7（5）：783-786.

［7］李莉，彭建營，白瑞霞，等. SRAP與TRAP 標記及其在園藝植物研究中的應用［J］. 西北植物學報，2006，26（8）：1749-1752.

［8］邱文武，孫偉生，竇美安. 基于PCR的新型分子標記SRAP研究進展［J］. 江西農業學報，2007，19（8）：26-28.

［9］李嚴，張春慶. 新型分子標記-SRAP技術體系優化及應用前景分析［J］. 中國農學通報，2005，21（5）：108-112.

［10］柳李旺，龔義勤，黃浩，等. 新型分子標記-SRAP與TRAP及其應用［J］. 遺傳，2004，26（5）：777-781.

［11］Liu L，Guo W，Zhu X，et al. Inheritance and fine mapping of fertility restoration for cytoplasmic male sterility inGossypium hirsutumL. ［J］.Theor Appl Genet，2003，106：461- 469.

［12］劉小飛，廖飛雄，劉曉榮，等. 雞冠花誘變選育系和栽培選育系的SRAP分子鑒定［J］. 北方園藝，2013（7）：128-130.

［13］王明明，陳化榜，王建華，等. 木瓜屬品種親緣關系的SRAP分析［J］. 中國農業科學，2010，43（3）：542-551.

［14］王曉菡，郭先鋒，孫憲芝，等. SRAP標記在園藝植物研究中的應用［J］. 山東農業大學學報（自然科學版），2009，40（4）：650-654.

［15］Renganayaki K，Read J C，Fritz A K. Genetic diversity among Texas bluegrass genotypes（Poa arachniferaTorr.）revealed by AFLP and RAPD markers［J］. Theoretic and Applied Genetics，2001，102：1037-1045.

［16］Sun G，Bond M，Nass H，et al. RAPD polymorphisms in spring wheat cultivars and lines with different level of Fusarium resistance［J］. Theoretic and Applied Genetics，2003，106：1059-1067.