橡膠林土壤微生物碳代謝功能多樣性及其變化

周玉杰，李建華，張廣宇，王 寧，譚文麗，王永鵬，王春燕，曹啟民

（1. 海南省農墾科學院，海南 ?？?570206；2. 海南省農墾農業科學研究所，海南 ?？?570311）

土壤微生物是土壤的重要組成部分，是生態系統的分解者，它積極參與生態系統中的物質循環和能量流動，在維持生態系統的結構、功能方面起著極其重要的作用，研究土壤微生物群落功能多樣性是理解生態系統過程的核心內容之一［1］。隨著全球生態系統CO2氣體濃度的持續升高，如何減少碳釋放及增強固碳能力成為當前人們關注和研究的熱點。而土壤是陸地生態系統中最大的碳庫，同時也是最活躍的碳庫之一，土壤微生物影響著土壤有機碳的轉化，是整個生態系統碳循環的“關鍵”和“動力”［2］，但兩者之間的相互作用復雜而微妙，土壤微生物與土壤碳循環以及其他生態服務功能之間的關系及相互作用機制一直以來都是土壤生態學研究的難點和熱點。開展土壤微生物碳代謝功能多樣性研究，將有利于推進微生物介導的土壤生態系統乃至整個陸地生態系統碳循環機制及其他生態服務功能研究。

我國自1904年開始引種橡膠樹以來，經過長期的艱苦奮斗，打破了橡膠樹種植的傳統禁區，形成了海南、云南、廣東三大主要植膠區。橡膠樹成為我國熱帶地區的主要經濟作物，橡膠林生態系統已成為較大的人工生態系統之一，橡膠林對維持區域生態系統平衡發揮著重要的作用。但我國的第一代橡膠林基本上都是在自然植被的土地上建立起來的，橡膠樹作為多年生喬木，在長期大規模替代自然植被背景下，隨著時間的不斷推移，是否對土壤微生物群落結構和功能產生影響？在實際研究工作當中，土壤生態系統中起關鍵作用的微生物往往被忽視。

土壤微生物對不同碳源利用能力的差異，是描述土壤微生物群落特征的一個重要指標，土壤微生物群落功能多樣性可反映群落總體的動態變化。以往土壤微生物功能多樣性的測定方法主要有磷脂脂肪酸法 （PLFA）［3］和基于PCR的分子生物學分析方法［4］，但這兩種方法技術要求高，耗費時間長，實驗靈活性較差，又難以在較短時間內進行大量樣品處理。基于碳代謝的 Biolog-ECO 技術為微生物群落功能多樣性定量研究提供了一種靈敏度高、分辨性強、更加簡便快捷的方法，該方法已廣泛應用于不同土壤類型、不同植被物種下土壤及不同管理策略下的農業土壤微生物群落功能多樣性研究中［5-8］。因此，我們以海南大豐農場6個不同林齡橡膠林樣地為研究對象，運用Biolog-ECO技術對橡膠林土壤微生物群落碳代謝功能多樣性進行研究，分析橡膠林土壤微生物群落碳代謝功能多樣性在割膠前后的變化，以及對不同林齡橡膠林土壤微生物群落碳代謝功能多樣性的差異，為橡膠林土壤生態系統健康提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究區域位于海南省瓊中黎族苗族自治縣大豐農場。該區域為熱帶海洋季風氣候，年平均溫度22.8℃，最冷月平均氣溫為 16～18℃，年平均降雨量2 278 mm。試驗選取林齡5、10、13、18、25、30年常規栽培橡膠林作為試驗樣地，位于 19°14′～19°16′E、109°44′～109°45′N，海拔 175～207 m，每個樣地面積 1 hm2。橡膠樹栽培品系為PR107，株行距3 m×7 m。各樣地的立地條件、栽培管理措施和割膠制度基本一致。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集時間為割膠前（5月）和割膠后（11月）。在每個林齡橡膠林樣地內隨機選取5個采樣點，采集0～20 cm土層土壤，充分混合，迅速裝入樣品袋并置于冰塊上，土樣帶回實驗室后去掉植物根系和石塊，放入4℃恒溫冰箱內低溫保存。

1.3 土壤微生物功能多樣性測定

取樣后48 h內采用含有31種碳源的Biolog-ECO微平板培養技術測定土壤微生物群落碳代謝功能多樣性。具體方法為：稱取新鮮土樣5.00 g，加入45 mL無菌水后在搖床上振蕩30 min，然后將土壤樣品稀釋至10-3，再從中取150 μL該懸浮液接種到Biolog-ECO 微平板的每一個孔中，1 h內測定第一次吸光值，最后將接種的微平板放在28℃的恒溫培養箱中暗培養216 h，每隔24 h采用BIOLOG讀數儀（BIOLOG，Hayward，USA）測定各孔在750 nm和590 nm 波長下的光吸收值。

1.4 數據分析

在一定培養時間內Biolog-ECO 微平板的孔數變化和每孔顏色變化的程度與土壤微生物群落功能密切相關。根據相關研究文獻的方法［9］，測試板孔中溶液吸光值平均顏色變化率（AWCD），計算方法為：

式中，C為每個培養基孔的光密度值，R為對照孔的光密度值，n為培養基碳源種類數，Biolog-ECO 微平板n為31。

采用培養至72 h的Shannon-Wiener指數表征土壤中微生物群落多樣性，McIntosh指數表征土壤中微生物群落豐富度。

式中，Pi為第i孔的相對吸光值與所有反應孔相對吸光值總和的比值，即；ni為第i孔的相對吸光值（C-R）。

根據有關Biolog-ECO微平板培養時間對微生物相關數據分析的影響研究結果［10］，以及本研究中各樣地土壤微生物的AWCD增長曲線圖，多樣性指數選擇AWCD值處于快速增長時（72 h）的數據進行分析。采用EXCEL2003計算土壤微生物AWCD值及多樣性指數，DPS7.05進行方差分析，SPSS19.0進行主成分分析，Canoca4.5軟件進行典范對應分析（CCA）。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物AWCD值及變化

AWCD值可作為衡量微生物群落整體活性的有效指標，AWCD值的變化速率和最終達到值反映了土壤微生物群落利用碳源的能力。AWCD值越大，表明微生物的碳代謝活性越高，利用碳源的能力越強。培養0～24 h，各樣地土壤微生物AWCD值變化均較小，培養24～72 h土壤微生物AWCD值快速增長，培養72 h后增長速度減慢并一直延續到144 h，培養144 h 后增長速率趨于平穩（圖1）。

圖1 橡膠林土壤微生物AWCD增長曲線

培養至72 h 的AWCD值，除林齡5年橡膠林割膠前后差異不明顯外，林齡10、13、18、25、30年橡膠林5月份均高于11月份。不同林齡橡膠林AWCD值在割膠前后的變化不同。割膠前（5月）林齡10、30年橡膠林極顯著高于林齡5、18、25年橡膠林，林齡13年橡膠林極顯著高于林齡18年橡膠林，其他林齡橡膠林間差異不顯著；而割膠后（11月）AWCD值以林齡5年橡膠林最高，其次為林齡8年和25年橡膠林，林齡10、13、30年橡膠林較低。其中林齡5年橡膠林顯著高于林齡25年橡膠林，極顯著高于林齡10、13、25、30年橡膠林；林齡18年和25年橡膠林極顯著高于林齡10、13、30年橡膠林（圖2）。

圖2 不同林齡橡膠林土壤微生物AWCD值

2.2 土壤微生物碳代謝功能多樣性指數

2.2.1 割膠前后土壤微生物群落功能多樣性指數變化 割膠前林齡10、13、30年橡膠林Shannon-Wiener指數極顯著高于割膠后，林齡5、18、25年橡膠林間割膠前與割膠后的Shannon-Wiener指數差異不明顯。McIntosh指數除林齡5年橡膠林外，其他林齡橡膠林間割膠前McIntosh指數均極顯著高于割膠后（圖3）。

圖3 不同林齡橡膠林土壤微生物Shannon-Wiener指數

2.2.2 不同林齡橡膠林土壤微生物群落功能多樣性指數變化 割膠前Shannon-Wiener指數以林齡30年橡膠林最高，林齡18年橡膠林最低，林齡5、10、13、25年橡膠林間差異不顯著。McIntosh指數以林齡30年橡膠林最高，林齡5年橡膠林最低，林齡10、13、18、25年橡膠林間差異不顯著（圖3、圖4）。

割膠后Shannon-Wiener指數以林齡5年橡膠林最高，林齡13年橡膠林最低，林齡10、18、25、30年橡膠林間差異不顯著。McIntosh指數以林齡5年橡膠林最高，其次為林齡18年和25年橡膠林，林齡10、13、30年橡膠林較低（圖3、圖4）。

圖4 不同林齡橡膠林土壤微生物McIntosh指數

2.3 橡膠林土壤微生物對碳源的利用及變化

2.3.1 橡膠林土壤微生物對碳源的利用 對31種碳源的利用情況進行主成分分析，其中前3個主成分累積貢獻率為86.077%，說明主成分1、2、3是變異的主要來源。3個主成分的特征值分別為15.649、7.663、1.976，貢獻率分別為50.480%、4.720%和6.373%（圖5）。

圖5 橡膠林土壤微生物利用碳源的主成分分析

通過計算31種碳源的綜合得分，可以看出橡膠林土壤微生物群落利用D-甘露醇、腐胺、苯乙胺、R-羥丁酸及衣康酸能力較強（綜合得分＞0.5），而對環式糊精、吐溫80、甘氨酰-L-谷氨酸、α-D乳糖、肝糖、D-木糖和赤蘚糖醇利用能力較差，綜合得分低于平均水平（圖6）。

圖6 橡膠林土壤微生物利用31種碳源的綜合得分

土壤微生物對不同類型碳源的利用能力程度，有助于更全面地了解土壤微生物群落功能特性［11-12］。將Biolog-ECO微平板上的31種碳分為糖及衍生物類（Carbohydrates）、氨基酸類（Amino acids）、羧酸類（Carboxylic acids）、酚酸類（Phenolic acids）、多聚物類（Polymers）和胺類（Amines）六大類型［13］。CCA分析表明，橡膠人工林土壤微生物群落對胺類、羧酸類、氨基酸類和糖及衍生物類碳源利用能力較強，而對酚酸類和多聚物類碳源的利用能力較差（圖7）。

2.3.2 橡膠林土壤微生物利用碳源變化 通過主成分分析，計算橡膠林土壤微生物群落利用碳能力的綜合得分，可以看出割膠前橡膠林土壤微生物群落利用碳的能力要高于割膠后。不同林齡橡膠林土壤微生物群落在割膠前后利用碳源的變化也不同，割膠前為林齡30年＞10年＞25年＞13年＞18年＞5年，而割膠后為林齡5年＞18年＞25年＞30年＞13年＞10年（圖8）。

3 結論與討論

3.1 橡膠林土壤微生物活性及利用碳源類型

在培養0～168 h內，橡膠林土壤微生物AWCD值隨著培養時間延長而逐漸升高。這與其他學者的研究結果一致，即 AWCD 值隨著培養時間的延續呈現出微生物常規生長曲線［14-15］。

圖7 橡膠林土壤微生物利用碳源類型CCA排序

橡膠林土壤微生物群落利用D-甘露醇、腐胺、苯乙胺、R-羥丁酸及衣康酸的能力較強，而利用環式糊精、吐溫80、甘氨酰-L-谷氨酸、α-D乳糖、肝糖、D-木糖和赤蘚糖醇的能力較差?？偟膩砜?，橡膠林土壤微生物群落對羧酸類、氨基酸類、胺類和糖及衍生物類利用能力較強，而對酚酸類和多聚物類的利用能力較差。這與其他天然次生林和人工林利用碳的類型基本一致，以往研究即得出土壤微生物利用率最高的是糖類、氨基酸類和羧酸［16-17］，并認為糖類、氨基酸類和羧酸類是區分土壤微生物群落功能多樣性最主要和最敏感的碳源［18］。

圖8 橡膠林土壤微生物利用碳源的綜合得分

3.2 割膠對橡膠林土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響

除林齡5年橡膠林外，林齡10、13、18、25、30年橡膠林割膠前的AWCD值均高于割膠后；割膠前Shannon-Wiener指數和McIntosh指數均以林齡30年橡膠林最高；割膠后Shannon-Wiener指數和McIntosh指數均以林齡5年橡膠林最高；不同林齡橡膠林土壤微生物群落利用碳能力割膠前為林齡30年＞10年＞25年＞13年＞18年＞5年，而割膠后為林齡5年＞18年＞25年＞30年＞13年＞10年。說明割膠前橡膠林土壤微生物AWCD值、多樣性指數和碳源利用能力要高于割膠后，割膠導致處于膠乳生產期的林齡10、13、18、25、30年橡膠林土壤微生物碳代謝功能多樣性下降，而林齡5年橡膠林由于尚未割膠，其土壤微生物功能多樣性未受到割膠的影響，因此在割膠后林齡5年橡膠林的土壤微生物功能多樣性要高于其他林齡橡膠林。割膠降低了土壤微生物群落的活性和碳代謝功能多樣性，其可能與割膠致使土壤養分大量流失有關，以往研究即認為土壤微生物群落功能多樣性與土壤養分密切相關［19-21］。

土壤微生物的活性和功能多樣性降低是反映土壤生態系統質量和人類活動脅迫效應的重要生態指標［22］。健康土壤是橡膠樹正常生長的保證，而土壤微生物多樣性則是維持土壤健康和土壤質量的關鍵。因此，提高土壤微生物群落的活性和功能多樣性，可以提高土壤肥力和結構，從而提高橡膠林的經濟效益。建議根據不同林齡橡膠林的特點進行膠林土壤培肥改良，為土壤微生物創造良好的生長環境，以改善橡膠林土壤微生物群落的結構和功能，增強橡膠林的可持續生產能力；同時重視橡膠林土壤微生物功能多樣性的研究，揭示橡膠人工林土壤生態系統“植物—土壤—微生物”三者之間的關系，為橡膠林生態系統健康以及土壤生態系統碳循環機制研究提供理論支撐。

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