神經營養因子3-殼聚糖載體對大鼠運動皮層損傷后內源性神經發生和運動功能的效果

楊飛祥，張皚峰，郝鵬，尚俊奎，段紅梅，楊朝陽,3，李曉光,3

·基礎研究·

神經營養因子3-殼聚糖載體對大鼠運動皮層損傷后內源性神經發生和運動功能的效果

楊飛祥1，張皚峰2，郝鵬1，尚俊奎1，段紅梅1，楊朝陽1,3，李曉光1,3

目的觀察神經營養因子3(NT3)-殼聚糖載體對大鼠運動皮層損傷后的前肢行為學功能恢復的效果，并檢測其對損傷區及側腦室下區神經干細胞(NSCs)的增殖和分化的影響。方法65只Wistar大鼠分為正常對照組(n=7)、單純損傷組(n=29)和NT3-殼聚糖組(n=29)。制作大鼠運動皮層吸除損傷性腦損傷模型。NT3-殼聚糖組于手術后立即植入NT3-殼聚糖載體，單純損傷組不給予任何治療措施。分別于術后3 d、7 d、14 d、1個月、2個月和3個月，應用食物球抓取實驗觀察大鼠前肢功能恢復情況，應用HE染色觀察損傷區的空腔體積，應用免疫熒光染色評價NSCs的增殖和分化。結果NT3-殼聚糖組右側前肢抓取成功率高于單純損傷組右側(F＞6.00,P≤0.05)。NT3-殼聚糖組空腔體積均顯著小于單純損傷組(F＞629.5,P＜0.001)。在NSCs分化實驗中，NT3-殼聚糖組各時間點損傷區BrdU細胞數均顯著高于單純損傷組(F＞171.43,P＜0.001)。在NSCs增殖實驗中，NT3-殼聚糖組BrdU陽性細胞數顯著高于正常對照組和單純損傷組(F＞155.06,P＜0.001)，術后7 d損傷同側Dcx陽性細胞數顯著高于單純損傷組(F=62.367,P＜0.001)，BrdU/Dcx雙陽性細胞數顯著高于正常對照組(F=33.527,P＜0.001)。結論NT3-殼聚糖載體可增加腦損傷所致的側腦室下區NSCs的增殖，促進損傷區新生神經元的發生以及大鼠前肢運動功能恢復。

創傷性腦損傷；神經營養因子3；殼聚糖；內源性神經發生；運動功能；大鼠

[本文著錄格式]楊飛祥，張皚峰，郝鵬，等.神經營養因子3-殼聚糖載體對大鼠運動皮層損傷后內源性神經發生和運動功能的效果[J].中國康復理論與實踐,2017,23(2):155-161.

CITED AS:Yang FX,Zhang AF,Hao P,et al.Effect of neurotrophin 3-chitosan on endogenous neurogenesis and motor function after motor cortex injury in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(2):155-161.

創傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是一種常見的外力引起的神經外科疾病，其治療方法對神經外科醫生而言是一個很大的挑戰[1]。大腦受到損傷后，由于猛烈的外力撞擊，損傷中心和周圍腦組織會發生壞死，同時伴有重要生理功能神經元死亡，導致其所調控的運動功能障礙和意識缺失[2]。隨著損傷區周圍組織和細胞丟失，會引起繼發性損傷，如缺血、水腫、興奮性神經遞質釋放和炎癥反應等[3]，而損傷后興奮性神經遞質的釋放、炎癥因子的浸潤和膠質瘢痕的形成等損傷微環境都不利于神經發生。

大腦皮層是一個包含幾十種神經元類型的復雜細胞集合區，與大腦的其余區域密切聯系，從而對身體形成多樣化和精細的調控[4]。研究表明，成年哺乳動物腦內仍然存在持續神經發生的區域，如嗅球(olfactory bulb,OB)和海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)[5]。在腦內的側腦室下區[6]、海馬齒狀回下區[7]和脊髓的中央管[8]等也發現神經干細胞(neural stem cell,NSCs)，在腦內發揮著重要作用。隨著腦內NSCs的發現，增強內源性神經發生為治療腦損傷提供了新的思路，成為非常有前景的一種治療方法。

本課題組既往研究表明，神經營養因子3(neurotrophin 3,NT3)-殼聚糖載體可以在生理狀態下緩慢釋放NT3長達14周[9]，并通過激活TrkC受體促進NSCs的增殖，提高神經元分化的比例[10]。最近研究發現，NT3-殼聚糖載體能夠激活大鼠完全性脊髓橫斷后脊髓內源性NSCs，誘導其分化成功能性神經元并與宿主脊髓建立功能性神經環路，最終導致截癱后功能的恢復，是迄今為止最接近臨床應用的治療脊髓損傷的方法[11]。應用加權關聯網絡分析方法(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)分析也顯示，NT3-殼聚糖載體對增強神經發生、減少炎癥反應和促進血管發生方面發揮著重要的作用[12]。

在腦損傷方面，既往研究發現，NT3-殼聚糖載體可以促進海馬CA1區損傷后核因子(nuclear factor,NF)陽性細胞和軸突的產生，進而提高大鼠認知功能[13]。海馬CA1區以上皮質主要包括聯絡皮質和一小部分次級感覺運動皮質，目前沒有方法檢測該皮質損傷后大鼠的運動功能恢復情況，因此制備大鼠運動皮質損傷并觀察功能恢復非常重要。

本實驗應用自制腦吸除裝置制作成年Wistar雌性大鼠運動皮層吸除性腦損傷模型，根據在損傷區是否移植NT3-殼聚糖載體，分為單純損傷組和NT3-殼聚糖組，同時設有正常對照組。免疫熒光染色觀察損傷區和側腦室下區NSCs的增殖和分化以研究內源性神經發生，食物抓取行為學實驗評估大鼠前肢功能恢復情況。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

65只成年Wistar大鼠，雌性，體質量220 g，SPF級，首都醫科大學實驗動物部提供，許可證號SYXK (京)2013-0004。所有動物分為正常對照組(n=7)、單純損傷組(n=29)和NT3-殼聚糖組(n=29)。

所有動物實驗均經倫理委員會審批，并按照首都醫科大學實驗動物中心和北京實驗動物協會的標準執行。

1.2 模型制備

采用自制的腦吸除裝置制備成年大鼠吸除性腦運動皮層損傷模型。6%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射麻醉，大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，備皮后沿中線切開皮膚及皮下組織，暴露顱骨，確定前囟位置并標記。以前囟-0.5～+1.5 mm，左旁開1～3 mm為標記，用牙科鉆鉆開一個2×2 mm大小的骨窗，注意不要損傷硬腦膜。手術顯微鏡下切開硬腦膜，應用自制的腦吸除裝置吸除左側運動皮層，吸除深度1 mm，吸除腦組織體積為2×2×1 mm。

NT3-殼聚糖組于手術后立即植入NT3-殼聚糖載體，單純損傷組不給予任何治療措施。術后縫合皮膚，碘伏消毒傷口，于溫暖環境中待大鼠蘇醒，給予食水。術后第1天腹腔注射青霉素10萬U/次，每天1次，連續注射7 d。

1.3 內源性NSCs標記

單純損傷組和NT3-殼聚糖組取各取9只大鼠分別于3 d、7 d和14 d取材3只，正常對照組取3只于7 d取材，取材前7 d開始腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromo-2?-deoxyuridine,BrdU)100 mg/kg，每天注射1次，連續注射7 d，來觀察NSCs增殖情況。

單純損傷組和NT3-殼聚糖組各取20只大鼠術后立即開始腹腔注射BrdU 100 mg/kg，每天注射1次，連續注射7 d，分別于7 d、14 d、1個月、2個月各取材3只，來觀察NSCs分化情況。剩余大鼠備用。

1.4 動物灌流和組織標本處理

6%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射麻醉，生理鹽水沖洗血管，4%多聚甲醛灌流固定，小心取出腦組織，置于4%多聚甲醛于4℃冰箱固定過夜。30%蔗糖脫水1周。取出脫水后的大腦，可以看到皮層損傷區，應用大鼠腦模具對大腦修塊，取以損傷區為中心，前后各1 mm大腦組織塊，冰凍切片機連續切片，切片厚度30 μm，均勻分成六套，每套10個切片，-20℃冰箱保存。

1.5 HE染色

取出一套冰凍切片，室溫復溫0.5 h；蒸餾水搖床浸潤2 min，共2次；蘇木素10 min，蒸餾水清洗；1%鹽酸酒精分化15 s，自來水返藍8 min，蒸餾水清洗；伊紅1 min，蒸餾水清洗；75%乙醇2 min，80%乙醇2 min，90%乙醇2 min，95%乙醇2 min，100%乙醇2 min，共2次；二甲苯Ⅰ2 min，二甲苯Ⅱ2 min；中性樹膠封片，通風櫥晾干，顯微鏡觀察攝片，Image-Pro Plus 6.0軟件分別于7 d、1個月、3個月測量損傷區空腔體積。

1.6 免疫熒光染色和試劑

選取各組術后3 d、7 d、14 d、1個月和2個月時間點的一套腦組織切片，一抗4℃孵育60 h，二抗常溫避光孵育8 h，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI，1∶3000)，室溫繼續孵育5 min，50%甘油磷酸緩沖液(phosphate buffer, PB)封片，熒光顯微鏡下觀察。Image-Pro Plus 6.0軟件照相并計數。

小鼠抗BrdU(1∶200)：SIGMA公司。兔抗Nestin (1∶100)：SIGMA公司。兔抗Tuj-1(1∶500)：MILLIPORE公司。兔抗Dcx(1∶200)：SIGMA公司。Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠熒光二抗(1∶200)、Alexa Fluor 594標記山羊抗兔熒光二抗(1∶200)：INVITROGEN。

1.7 食物球抓取行為學實驗

手術前2周各組取4只大鼠進行食物抓取訓練，訓練開始前1 d禁食，以后定量喂食。將食物球(質量100～125 mg、直徑0.2～0.3 mm)放置測試盒(無蓋玻璃盒，45×18×38 cm，前端玻璃面中間有1 cm縫)前段的食物架上兩個圓孔內，大鼠前肢可以通過中間縫抓取圓孔內的食物球，手動訓練大鼠來抓食物球。每天每只大鼠抓取20個食物球后放回籠子，定量喂食(25～30)g/d。一般2周后，大鼠前肢抓取動作熟練，此時，測定4只正常大鼠左前肢和右前肢一次成功抓取20個食物球的成功率，作為基準。然后進行皮層損傷手術，并于3 d、7 d、14 d，1個月、2個月和3個月時間點取單純損傷組和NT3-殼聚糖組各4只進行行為學評價。

1.8 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，所有的數據均以(±s)表示。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結果

2.1 食物球抓取成功率

正常對照組大鼠兩側前肢的食物抓取成功率為60%，左右側前肢無明顯差異。單純損傷組右側前肢術后3 d的抓取成功率小于5%，隨著時間延長，抓取成功率逐漸升高，最高達18.75%。術后1個月、2個月和3個月，NT3-殼聚糖組右側前肢抓取成功率高于單純損傷組右側(P≤0.05)。

2.2 空腔體積

術后7 d、1個月、3個月，NT3-殼聚糖組還能看到未降解的NT3-殼聚糖載體，且損傷區內填充有大量的再生腦組織，NT3-殼聚糖組空腔體積均顯著小于單純損傷組(P＜0.001)。見圖1、表2。

2.3 NSCs分化情況

NT3-殼聚糖組各時間點損傷區BrdU細胞數均顯著高于單純損傷組(P＜0.001)。見圖2A、2B，表3。為了明確這些增殖細胞的類型，我們進行免疫熒光雙標記。術后14 d，NT3-殼聚糖組損傷區內檢測到大量Nestin陽性細胞，其中有與BrdU共標記(圖2C、2D)。術后1個月，相比單純損傷組，NT3-殼聚糖組大鼠的損傷區可檢測到更多的Tuj1陽性神經元，其中有與BrdU共標記(圖2E、2F)。

表1 各組各時間點食物球成功抓取率比較(%)

圖1 術后7 d單純損傷組和NT3-殼聚糖組損傷區空腔體積(HE染色)

圖2 各組大腦切片損傷區免疫熒光染色

表2 各組各時間點空腔體積比較(mm3)

表3 各組各時間點損傷區BrdU細胞數(/mm3)

2.4 NSCs增殖情況

正常對照組BrdU陽性細胞分布比較稀疏。NT3-殼聚糖組BrdU陽性細胞于術后3 d開始增多，術后7 d達到高峰(P＜0.001)，且顯著高于正常對照組和單純損傷組(P＜0.001)。術后14 d仍維持在較高水平(P＜0.05)。見表4、圖3。

圖3 各組術后7 d大腦切片側腦室下區BrdU免疫熒光染色(bar=200 μm)

圖4 各組術后7 d大腦切片側腦室下區BrdU(紅色)/Dcx(綠色)免疫熒光染色(bar=40 μm)

NT3-殼聚糖組術后7 d損傷同側Dcx陽性細胞(168.250±14.014)/mm3顯著高于單純損傷組(98.345± 7.250)/mm3(F=62.367,P＜0.001)，且NT3-殼聚糖組BrdU/Dcx雙陽性細胞數(104.470±17.084)相比正常對照組(30.840±2.653)顯著增加(F=33.527,P＜0.001)。見圖4。

表4 各組各時間點損傷區BrdU細胞數(/mm3)

3 討論

目前研究表明，腦內不僅存在NSCs，而且神經發生貫穿整個生命周期[14]。應用組織工程學方法，通過緩慢釋放支持再生的神經營養因子，創造有利于自我修復的微環境，進而增強內源性神經發生，成為治療中樞神經損傷的新策略，這種策略是修復神經損傷最理想的辦法。

前期研究證明，NT3-殼聚糖載體可促進脊髓[15]和海馬[16]損傷后的神經發生和功能恢復，激活內源性NSCs，促進成熟神經元產生，和宿主形成功能性的神經網絡。本研究基于此治療策略來治療大腦皮層損傷，發現其能促進大鼠行為學恢復，并增強損傷區和側腦室下區NSCs的增殖和分化。研究表明，運動皮層損傷會激活側腦室下區和海馬齒狀回下區的NSCs增殖，部分激活的NSCs會異位遷移到損傷皮層，但大多分化成膠質細胞，很少向神經元分化[17-18]。在本研究中，將NT3和殼聚糖通過氫鍵作用連接一起，可實現在生理狀態下的長期緩慢釋放NT3，長達14周〔可溶性NT3在常溫下半衰期是(1.28±0.07)min〕，從而改善損傷區局部惡劣的炎癥微環境，一方面減輕繼發性損傷所帶來的傷害，另一方面能夠保護新生的神經組織，繼而促進內源性的神經發生[15]。

在食物球抓取行為學試驗中，術后損傷對側前肢抓取成功率明顯降低，證明TBI手術成功，運動皮質吸除后可引起大鼠損傷對側前肢的運動功能障礙。雖然隨著術后時間的延長，單純損傷組大鼠損傷對側前肢的功能有自發性恢復傾向，但食物抓取成功率并未達正常對照組水平。NT3-殼聚糖組大鼠在術后短時間內前肢的運功功能無明顯改善，可能與新生神經元數量較少和新生神經元尚不成熟有關。在2～3個月期間內NT3-殼聚糖組比單純損傷組成功率高，說明NT3-殼聚糖可以改善運動皮質損傷所致的大鼠前肢運動功能下降。

本研究采用HE染色觀察術后NT3-殼聚糖組和單純損傷組空腔體積的差異。與單純損傷組相比，NT3-殼聚糖組空腔體積明顯減小，并且損傷區內填充有大量的再生腦組織。說明大鼠行為學功能的恢復可能與NT3-殼聚糖減少損傷區空腔體積，并促進腦組織再生有關。為了明確這些增殖細胞的類型，我們進行免疫熒光雙標記。術后14 d，NT3-殼聚糖組損傷區內檢測到大量Nestin陽性細胞，其中有與BrdU共標記，說明這些細胞是損傷后新生的，NT3-殼聚糖可以激活內源性NSCs，并促進它們向損傷區的遷移。術后1個月，NT3-殼聚糖組大鼠的損傷區可檢測到Tuj1陽性神經元，其中有與BrdU共標記，說明遷移至損傷的NSCs可以分化為神經元，NT3-殼聚糖促進TBI后的神經發生。

損傷區內檢測到的新生神經元可能來源于前腦神經發生區側腦室下區的NSCs。因此我們檢測損傷后NT3-殼聚糖載體對側腦室下區NSCs的影響。正常對照組大鼠側腦室下區檢測到少量的BrdU陽性細胞，細胞分布比較稀疏。我們在NT3-殼聚糖組的損傷側側腦室下區觀察到增生細胞增多。

Dcx是遷移細胞的標記物，應用BrdU和Dcx的免疫熒光雙標記可以觀察并定量遷移的NSCs。NT3-殼聚糖組術后7 d損傷同側Dcx陽性細胞顯著增多，并且NT3-殼聚糖組BrdU/Dcx雙陽性細胞數相比正常對照組顯著增加。這一結果說明，NT3-殼聚糖載體增加側腦室下區新生NSCs的數量。

遷移到損傷區的NSCs可能是來自于側腦室下區或海馬齒狀回下區，也可能來自于新皮層存在的NSCs[17]。研究表明，缺血性腦損傷模型中，損傷區用sox2和Nestin來標記NSCs，同時也發現表達膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的細胞，表明這些細胞可能來自于損傷區皮層激活的星形膠質細胞[19]。在本研究中，損傷區的NSCs可能來自于側腦室下區，因為側腦室下區在損傷后經NT3-殼聚糖載體修復后，檢測到大量新生遷移的NSCs。但新生神經元的明確來源有待于進一步探究。

TBI后通過內源性神經發生修復大腦損傷，可以避免外源性NSCs移植修復腦損傷所產生的外來細胞不可控制的增生問題；把這些再生的細胞有效整合到正常的腦組織并發揮功能，是治療TBI的手段[20]。腦本身的原始自發恢復能力是有限的，在損傷區域NSCs很難自發神經分化，通過一些外在方法來加強內源性過程非常必要[21]。

在未來研究中，腦損傷修復問題會一直是重大的醫學研究熱點。而利用生物材料系統促進內源性神經發生，既不涉及倫理學問題，也不會引起免疫排斥反應。哺乳動物腦內多個區域存在NSCs，損傷區內的NSCs來源問題和如何特異性誘導分化將是我們研究的重點。未來有可能會實現神經前體細胞特異性活化為目標神經元和膠質細胞。

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Effect of Neurotrophin 3-chitosan on Endogenous Neurogenesis and Motor Function after Motor Cortex Injury in Rats

YANG Fei-xiang1,ZHANG Ai-feng2,HAO Peng1,SHANG Jun-kui1,DUAN Hong-mei1,YANG Zhao-yang1,3,LI Xiao-guang1,3
1.Department of Neurobiology,Capital Medical University,Beijing 100069,China；2.Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University,Beijing 100050,China；3.Department of Biomedical Engineering,School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China

LI Xiao-guang.E-mail:lxgchina@sina.com

ObjectiveTo observe the effects of neurotrophin 3(NT3)-chitosan on motor function,and proliferation and differentiation of the neural stem cells(NSCs)in the injury area and subventricular zone(SVZ)in rats with motor cortex injury.MethodsSixty-five Wistar rats were divided into control group(n=7),injury group(n=29)and NT3-chitosan group(n=29).The motor cortex was aspirated and removed as cerebral injury model.NT3-chitosan was immediately implanted into the injured area after operation,and the control group received no intervention.Pellet reaching test was performed to detect the recovery of the forelimb function,HE staining was used to observe the lesion cavity size,and immunofluorescence staining was used to observe the proliferation and differentiation of NSCs 3 days,7 days,14 days,1 month,2 months and 3 months after operation.ResultsThe grasp success rate was higher(F＞6.00,P≤0.05),and the lesion cavity size was significantly smaller(F＞629.5,P＜0.001)in the NT3-chitosan group than in the injury group.In the NSCs differentiation experiment,the number of BrdU cells at all the time points was significantly higher in the NT3-chitosan group than in the injury group(F＞171.43,P＜0.001).In the NSCs proliferation experiment,the number of BrdU positive cells was still significantly higher in the NT3-chitosan group than in the control group and in the injury group(F＞155.06,P＜0.001),the number of Dcx positive cells was significantly higher in theNT3-chitosan group than in the injury group(F=62.367,P＜0.001),and the number of BrdU/Dcx positive cells was significantly higher in the NT3-chitosan group than in the control group(F=33.527,P＜0.001).ConclusionNT3-chitosan could activate NSCs in the SVZ,and promote endogenous neurogenesis and forelimb function recovery in rats after motor cortex injury.

traumatic brain injury；neurotrophin 3；chitosan；endogenous neurogenesis；motor function；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.02.008

R651.1

A

1006-9771(2017)02-0155-07

2016-10-20

2016-12-02)

1.國家自然科學基金重點項目(No.31130022)；2.國家自然科學基金國際(地區)合作與交流項目(No.31320103903)；3.國家自然科學基金面上項目(No.31271037；No.31670988)；4.國家自然科學基金應急管理項目(No.31650001)；5.高等學校全國優秀博士學位論文作者專項資金資助項目(No.201356)。

1.首都醫科大學基礎醫學院，北京市100069；2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院口腔科，北京市100050；3.北京航空航天大學生物與醫學工程學院，北京市100191。作者簡介：楊飛祥(1990-)，男，漢族，河南開封市人，碩士研究生，主要研究方向：中樞神經系統創傷性腦損傷和修復。通訊作者：李曉光。郵箱:lxgchina@sina.com。