大鼠細胞外信號調節激酶1基因3?非編碼區雙熒光素酶報告載體的構建及rno-miR-15b-5p對其活性的影響

羅漢將，徐云峰，李曉曉，楊予濤，徐志卿

大鼠細胞外信號調節激酶1基因3?非編碼區雙熒光素酶報告載體的構建及rno-miR-15b-5p對其活性的影響

羅漢將1，徐云峰2，李曉曉1，楊予濤1，徐志卿1

目的以大鼠細胞外信號調節激酶1(ERK1)基因3?非編碼區(UTR)為研究對象，構建含有ERK1基因3?UTR區的野生型以及突變型重組雙熒光素酶報告載體，通過分析雙熒光素酶報告載體的活性，明確rno-miR-15b-5p對報告載體的調節作用。方法采用miRNeasy Mini Kit提取大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞的總RNA，以PC12細胞的cDNA為模板，利用聚合酶鏈式反應(PCR)將ERK1基因3?UTR克隆到pmiR-RB-ReportTMvector中。利用重疊延伸PCR，將ERK1基因3?UTR中的rno-miR-15b-5p潛在的靶序列TGCTGCT分別突變成CGAACGT和GTACACG，并將突變的ERK1基因3?UTR克隆到pmiR-RB-ReportTMvector中。結果成功構建了包含ERK1基因3?UTR區的野生型報告載體pmiR-ERK13?UTR和突變型報告載體pmiR-ERK1-mut 3?UTR。利用熒光素酶活性檢測系統，發現rno-miR-15b-5p mimic可以降低野生型報告載體的活性(P＜0.001)，但不影響突變型報告載體的活性。結論成功構建ERK1基因3?UTR區野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，初步證明ERK1基因3?UTR區是rno-miR-15b-5p的結合靶點。

rno-miR-15b-5p；細胞外信號調節激酶1；重疊延伸聚合酶鏈式反應；pmiR-ERK13?UTR；pmiR-ERK1-mut 3? UTR；熒光素酶活性檢測

[本文著錄格式]羅漢將，徐云峰，李曉曉，等.大鼠細胞外信號調節激酶1基因3?非編碼區雙熒光素酶報告載體的構建及rno-miR-15b-5p對其活性的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(2):166-172.

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抑郁癥是以顯著而持久的心境低落、思維遲緩、認知功能障礙、意識活動減退和軀體癥狀為主要臨床特征的精神疾病，但關于抑郁癥發生的具體分子機制仍不明確。有研究表明，microRNAs(miRNAs)很可能作為一個重要的調節因子，通過影響突觸的可塑性、神經的發生以及基因的表達，參與抑郁癥發生[1]。

miRNAs是一類長度約為22個堿基的非編碼小片段單鏈RNA，是人類非編碼RNA中種類最多的一種。到目前為止，在動、植物以及病毒中已經發現有28,645個miRNAs分子，且有新的miRNA被陸續發現[2]。miRNAs在動、植物中主要參與基因的轉錄后調控，通過作用于靶基因3?端非編碼區(untranslated regions,UTR)的特定序列，切割降解靶基因的mRNA分子，調節靶基因的翻譯，從而發揮調節效應[3]。已有研究資料顯示，超過60%哺乳類動物基因受到miRNAs的調節[4]。

miRNAs參與多種生物學過程，對細胞的增殖、分化、凋亡和新陳代謝均起著重要的調節作用[5-8]。此外，在許多的病理過程如神經精神疾病[9]、腫瘤[10]及心血管病[11]中，都存在miRNAs表達異常的現象。

miR-15b是miR-15前體家族中的一員，參與調節腫瘤和骨骼的發生及分化等過程。研究發現，miR-15b可能作為一種成骨細胞的正向調節子，通過減少SmurfI介導的Runx2蛋白降解來促進成骨細胞分化[12]。miR-15b也被證實通過影響細胞周期進程和誘導細胞凋亡來抑制神經膠質瘤細胞的增殖[13]。

細胞外信號調節激酶1(extracellular signal-regulated kinase 1,ERK1)是由ERK1基因編碼的產物，是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族的一員，是Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的關鍵組成部分[14]。研究表明，ERK1主要調節細胞的黏附、生長、遷移、存活、增殖、分化以及新陳代謝等多種生理過程[15]，是多種信號通路共有的下游成分之一。此外，ERK1也參與多種病理學進程，許多原癌基因編碼的蛋白可通過ERK信號通路來產生細胞學效應[16]。ERK信號通路的持續激活可以加速誘發腫瘤[17]，但敲除ERK1基因的小鼠胸腺發育則存在障礙[18]。近期的一些研究表明，ERK信號通路也參與抑郁癥的發生[9]。

我們通過miRNAs、TargetScan、miRBase等生物信息學在線網站發現，大鼠ERK1基因的3?UTR區域存在與rno-miR-15b-5p互補配對的堿基序列，初步推測ERK1基因是rno-miR-15b-5p潛在的作用靶點。

本研究以大鼠ERK1基因為研究對象，通過克隆ERK1基因3?UTR區，并突變其與rno-miR-15b-5p作用的靶序列，構建ERK1基因3?UTR野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，通過熒光素酶報告基因系統分析rno-miR-15b-5p mimic對含有野生型及突變型ERK1基因3?UTR的雙熒光素酶報告載體活性的影響，初步確定rno-miR-15b-5p對ERK1基因的調節作用。該研究可為后續研究rno-miR-15b-5p通過調節ERK1基因的表達而影響大鼠的抑郁樣行為奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

大腸桿菌DH5ɑ菌株、大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)株為本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑

miRNeasy Mini Kit：QIAGEN，德國。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit：ROCHE，瑞士。Q5 High-Fidelity DNA polymerase、XhoI內切酶、NotI內切酶、Gel loading dye blue(6X)、T4 DNA連接酶：NEB，美國。DNA marker III：TIANGEN，中國。NucleoSpin?Gel and PCR Clean-up：MN，德國。E.Z. N.A.Plasmid Mini Kit I：OMEGA，美國。micrONTM miRNA mimic、pmiR-RB-ReportTMvector：RIBOBIO，中國。LipofectamineTM2000 Regent：INVITROGEN，美國。Dual-Luciferase?Reporter Assay System：PROMEGA，美國。Yeast Extract Powder、Tryptone、Agar Powder：USB，美國。NaCl：分析純，中國。

1.1.3 實驗儀器

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀：TECHNE，英國。低溫高速離心機：EPPENDORF，德國。NanoDrop 2000紫外分光光度計：THERMO，美國。PYY-7C恒壓恒流電泳儀：北京六一儀器廠。MLS-3750高壓滅菌鍋：SANYO，日本。DK-S22恒溫水浴箱：北京市長風儀器儀表公司。AlphaImage凝膠成像系統：HP，美國。Glommax 20/20 Luminometer檢測儀：PROMEGA，美國。

1.2 方法

1.2.1 基因序列的獲取與miRNAs靶點預測

利用GenBank得到大鼠ERK1基因的3?UTR序列。通過miRNA靶基因預測網站TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRBase(http://www.mirbase. org/)、microRNA(http://www.microrna.org/)預測與大鼠ERK1基因3?UTR區結合的miRNAs。

1.2.2 PC12細胞總RNA提取、反轉錄及PCR擴增

PC12細胞培養48 h后，利用miRNeasy Mini Kit提取總RNA，經紫外分光光度計NanoDrop 2000測得RNA濃度，利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄總RNA 1 μg，獲得大鼠cDNA。根據GenBank中ERK1基因的3?UTR序列，設計擴增其3? UTR的上游引物F-ERK和下游引物R-ERK(見表1)，以大鼠PC12細胞的cDNA作為模板，用上述引物進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μl，包含有5×Q5 Reaction Buffer 5 μl、5×Q5 High GC Enhancer Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTPs 2 μl、10 μmol/L上下游引物各1.25 μl、模板cDNA 0.5 μl、Q5 High-Fidelity DNA polymerase 0.25 μl、ddH2O 9.25 μl。擴增條件為98℃預變性30 s、98℃變性10 s、55℃退火10 s、72℃延伸20 s，共進行32個循環后，72℃后延伸2 min。擴增完成后進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并采用NucleoSpin?Gel and PCR Clean-up試劑盒純化回收目的區域PCR產物。

1.2.3 野生型重組雙熒光素酶報告載體的構建

用XhoI內切酶和NotI內切酶分別對上述擴增的PCR產物和pmiR-RB-ReportTMvector載體進行雙酶切，純化回收目的片段，然后用T4 DNA連接酶室溫連接2 h。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5ɑ中，37℃恒溫培養12～16 h，第2天進行菌落PCR和雙酶切鑒定，將陽性克隆送北京奧科鼎盛科技有限公司測序，測序正確的克隆命名為pmiR-ERK13?UTR。

1.2.4 突變型重組雙熒光素酶報告載體的構建

利用microRNA、TargetScan、miRBase等預測網站預測ron-miR-15b-5p與ERK1基因3?UTR結合的靶序列，將ERK1基因3?UTR中第242～248位堿基TGCTGCT(L1)突變為CGAACGT(M1)，將第501～507位堿基TGCTGCT(L2)突變為GTACACG(M2)。針對L1位點設計突變引物MF1和MR1；針對L2位點設計突變引物MF2和MR2(見表1)。

以構建好的野生型pmiR-ERK13?UTR質粒為模板，利用重疊延伸PCR進行堿基突變。針對L1位點的突變，需要進行兩組PCR。第一組PCR以MF1和R-ERK為引物進行擴增，第二組PCR以F-ERK和MR1為引物進行擴增。將上述兩組PCR擴增產物經電泳回收后，取等體積混合，以此為模板，利用F-ERK和R-ERK引物，進行重疊延伸PCR。將PCR產物經電泳回收，送北京奧科鼎盛科技有限公司測序，分析目的序列L1是否突變成功。

針對L2位點的突變，以L1位點突變成功的PCR產物為模板，進行兩組PCR，以F-ERK和MR2為引物的作為第一組，以MF2和R-ERK為引物的作為第二組。將兩組PCR產物電泳回收后，取等體積混合，以此為模板，以F-ERK和R-ERK為引物，再次進行重疊延伸PCR。將PCR擴增產物純化后，送北京奧科鼎盛科技有限公司測序，分析目的序列L2是否突變成功。將L1和L2位點均得到突變的PCR產物克隆到pmiR-RB-ReportTMvector載體中，并將其命名為pmiR-ERK1-mut 3?UTR。

1.2.5 細胞轉染

采用LipofectamineTM2000 Regent轉染試劑進行瞬時轉染，方法根據試劑盒中說明書進行。轉染前1 d，將PC12細胞接種到24孔細胞培養板中，每個孔中接種5×104個細胞，用含15%馬血清和2.5%胎牛血清的F-12K Nutrient Mixture培養液500 μl培養過夜。轉染當天，給細胞更換新鮮培養液。每個孔轉染100 ng重組質粒以及終濃度為100 nmol/L的micrONTM miRNA-15b-5p mimic或其Negative control(NC)中的一種。用Opti-MEM?I Reduced Serum Medium(OMEM)配制轉染混合液，取兩個1.5 ml的EP管，各加入OMEM 25 μl，其中一管加入重組質粒100 ng及100 nmol/L miR-15b-5p mimic或NC，另一管加入LipofectamineTM2000 Regent 2 μl。各自混勻后靜置5 min，隨后將兩者混勻后室溫靜置20 min制成轉染復合物。將上述轉染復合物均勻地滴加到細胞培養板各孔中。轉染48 h后裂解細胞，進行下一步熒光素酶活性檢測。上述實驗中，每組設置3個平行副孔，不進行轉染的細胞作為空白對照組，每組實驗重復3次。

1.2.6 雙熒光素酶活性檢測

實驗依據Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測熒光素酶活性。將轉染48 h后的PC12細胞用PBS洗滌2次，用Passive Lysis Buffer 100 μl裂解細胞20 min，隨后用Glommax 20/20 Luminometer檢測儀檢測。測量管中加LAR II試劑50 μl以及細胞裂解液10 μl，測定讀數記為熒光值1；再加入Stop&Glo reagent試劑50 μl，測定讀數記為熒光值2，以熒光值2/熒光值1的比值作為相對熒光素酶活性。

表1 引物序列

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 6.01統計軟件進行多因素方差分析檢驗。數據以(±s)表示。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結果

2.1 miRNA靶點預測

大鼠ERK1基因是rno-miR-15b-5p的潛在靶基因之一，rno-miR-15b-5p與ERK1基因結合位點見圖1。

2.2ERK13?UTR目的片段的擴增

以大鼠PC12細胞cDNA為模板，以F-ERK和R-ERK分別為上下游引物，利用Q5 High-Fidelity DNApolymerase進行PCR擴增，成功擴增出長度約為600 bp的擴增產物(圖2)，與預期大小一致。

2.3 野生型重組雙熒光素酶報告載體的構建

將上一步擴增產物及pmiR-RB-ReportTMvector用XhoI和NotI進行雙酶切處理，電泳回收ERK1基因3? UTR片段和線性載體片段，經T4連接酶連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌DH5ɑ。將菌落PCR鑒定為陽性的3個克隆進行酶切鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳分析，3個陽性克隆均切出大小約為6200 bp和600 bp的片段(圖3)，初步證明重組載體構建成功。將上述3個克隆分別測序，發現插入片段與大鼠ERK1基因3? UTR序列均一致，表明pmiR-ERK13?UTR野生型質粒構建成功。

2.4 突變型重組雙熒光素酶報告載體的構建

由于ERK1基因3?UTR存在兩個部分與rno-miR-15b-5p互補配對的靶序列L1和L2(圖1)，需要進行兩輪突變。第一輪：以上一步構建成功的野生型pmiR-ERK13?UTR重組質粒作為模板，以MF1和R-ERK以及F-ERK和MR1作為兩對突變引物分別進行針對L1位點的PCR擴增，得到大小約為367 bp和260 bp的PCR產物(圖4A)；將兩部分PCR產物回收純化，等比例混合后，作為模板，以F-ERK和R-ERK作為上下游引物，進行重疊延伸PCR，得到大小約為594 bp的產物(圖4B)。將重疊延伸PCR產物回收后送北京奧科鼎盛科技有限公司測序，與ERK13?UTR進行比對，發現L1成功突變成M1。第二輪：以第一輪突變PCR產物作為模板，以F-ERK和MR2以及MF2和R-ERK作為兩對突變引物進行針對L2的突變反應，得到大小約為518 bp和109 bp的PCR產物(圖4C)；將兩部分PCR產物回收純化，等比例混合后作為模板，以F-ERK和R-ERK作為上下游引物，進行重疊延伸PCR擴增，得到大小約為594 bp的PCR產物(圖4D)，并將該PCR產物測序，發現該PCR產物中的L1和L2位點均突變成功。

將L1和L2位點均突變的PCR產物以及pmiR-RB-ReportTMvector用XhoI和NotI進行雙酶切處理，得到ERK1-mut 3?UTR片段和線性載體片段，通過T4連接酶，將突變片段克隆到pmiR-RB-ReportTMvector載體中。對菌落PCR鑒定為陽性的3個克隆進行酶切分析，發現上述3個克隆酶切后均產生兩條亮帶(圖4E)，大小約為6200 bp和600 bp，與預期大小一致。將上述3個克隆分別測序，發現L1和L2位點均突變成功，見圖5。表明pmiR-ERK1-mut 3?UTR突變型質粒構建成功。

2.5 野生型和突變型重組報告載體的活性檢測

將正確構建的pmiR-ERK13?UTR或pmiR-ERK1-mut 3?UTR重組報告質粒與micrONTM miRNA-15b-5p mimic或NC分別共轉染至PC12細胞中，利用Dual-Luciferase?Reporter Assay System的方法檢測其熒光素酶活性，發現rno-miR-15b-5p mimic可以明顯下調野生型pmiR-ERK13?UTR報告載體活性，而對突變型pmiR-ERK1-mut 3?UTR報告載體活性無影響(圖6)。

圖1 rno-miR-15b-5p與ERK1基因的結合模式圖

圖2 ERK13?UTR的PCR擴增結果

圖3 重組質粒pmiR-ERK13?UTR的酶切鑒定

圖4 pmiR-ERK1-mut 3?UTR突變型載體的構建

圖5 野生型和突變型載體部分測序分析圖

圖6 rno-miR-15b-5p mimic/NC對野生型和突變型重組熒光素酶報告載體活性的影響

3 討論

根據堿基互補配對原理，miRNAs通過與特定基因mRNA的部分堿基序列進行互補配對，進而影響目的基因mRNA的表達水平及后續翻譯過程。在神經系統中，miRNAs也具有廣泛的表達，參與多種生物學過程。研究顯示，miR-137的過量表達可以促進成年神經干細胞的增殖，而敲減其表達則增強其分化[19]。miR-15b可以通過減緩細胞周期進程和誘導細胞凋亡來抑制神經膠質瘤細胞的增殖[13]。miR-124的異位表達可導致神經元早熟及生成的增多，而敲減其表達則導致腦室下區干細胞仍然處于未分化狀態[20]。此外，研究顯示，miRNAs也參與了突觸的形成和發育過程，影響突觸可塑性[21]。

ERK1/2主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化而激活，進入細胞核，通過修飾轉錄因子，影響基因的轉錄與表達。ERK1/2與細胞的增殖及分化關系密切。研究發現一些與增殖有關的信號分子可以通過與酪氨酸激酶受體[22]、G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor,GPCR)[23]、離子通道[24]等蛋白的相互作用而激活膜上Ras蛋白。GTP結合的Ras蛋白則可以激活蛋白激酶Raf-1，B-Raf，A-Raf (Rafs)[25]。Rafs可以通過磷酸化MEK1/2[26]，進一步激活下游的ERK1/2，而ERK1/2的激活可以調節Elk1[27]、c-Fos[28]和c-Jun[29]等轉錄因子的磷酸化水平，最終影響細胞的增殖和分化。

研究表明ERK1/2與疾病的發生也有密切的關系。在阿爾茨海默病模型小鼠海馬中，ERK1/2的表達存在異常[30]。在抑郁癥患者[31]和慢性溫和不可預期應激模型大鼠[32]海馬中，ERK1/2的磷酸化水平明顯降低。

為了研究在抑郁癥中miR-15b和ERK1兩者之間的關系，本研究利用microRNA、TargetScan、miRBase網站預測發現，rno-miR-15b-5p存在與靶基因ERK1基因3?UTR區互補配對的結合位點，并以此為基礎，利用PCR成功得到ERK1 3?UTR及其與rno-miR-15b-5p結合位點突變的ERK1-mut 3?UTR，成功構建其野生型和突變型的雙熒光素酶報告載體。

本研究選用的載體pmiR-RB-ReportTM是專門用來檢測miRNAs與mRNA相互作用的工具，通過將目的基因的3?UTR區克隆至海腎熒光素酶基因(hRluc)下游位點，以海腎熒光素酶基因作為報告基因，以螢火蟲熒光素酶基因(hluc)作為內參基因，通過檢測海腎熒光素酶活性的相對變化來鑒定miRNAs對該基因是否具有調控作用。由于該載體同時包含報告基因和內參基因，因此減少了共轉基因造成的實驗誤差，使得內參校準更加可靠。

本研究通過靶基因雙向預測、目的基因片段的克隆、重組以及突變等技術成功地構建了應用于miRNA靶基因檢測的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體pmiR-ERK1 3?UTR和pmiR-ERK1-mut 3?UTR。隨后，利用rno-miR-15b-5p mimic與pmiR-ERK1 3?UTR或pmiR-ERK1-mut 3?UTR共轉染PC12細胞進行熒光素酶活性檢測，發現rno-miR-15b-5p mimic可以明顯下調pmiR-ERK1 3?UTR的熒光素酶活性，表明大鼠ERK1基因是rno-miR-15b-5p的作用靶點。本研究為下一步深入探討rno-miR-15b-5p與ERK1在抑郁癥發病過程中的作用奠定了基礎。

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Construction of Rat Extracellular Signal-regulated Kinase 1 Gene 3?Untranslated Regions Dual-luciferase Reporter Plasmids and Effect of rno-miR-15b-5p on ItsActivitiy

LUO Han-jiang1,XU Yun-feng2,LI Xiao-xiao1,YANG Yu-tao1,XU Zhi-qing1
1.Captial Medical University School of Basic Medical Sciences,Beijing 100069,China；2.Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao,Shandong 266555,China

YANG Yu-tao,XU Zhi-qing.E-mail:yutaoy@ccmu.edu.cn(YANG Yu-tao),zhiqingx@ccmu.edu. cn(XU Zhi-qing)

ObjectiveTo construct dual-luciferase reporter plasmids containing the wild type and mutant rat extracellular signal-regulated kinase 1(ERK1)gene 3?untranslated regions(UTR)which were used to detect rno-miR-15b-5p's putative target gene.MethodsThe ratERK1gene 3?UTR fragment was amplified by polymerase chain reaction(PCR)from PC12 cell cDNA and cloned into pmiR-RB-ReportTMvector.The mutant ratERK1gene 3?UTR fragment was obtained by overlap PCR and inserted into pmiR-RB-ReportTMvector.Successful wild type and mutant recombinant plasmids were confirmed by DNAsequencing.PC12 cells were co-transfected with rno-miR-15b-5p mimic and pmiR-ERK13?UTR or pmiR-ERK1-mut 3?UTR and then analyzed by dual-luciferase reporter assay system.The achieved mutation sequence of the target site TGCTGCT was mutated to CGAACGT and GTACACG,respectively.ResultsThe wild-type reporter vector pmiR-ERK13?UTR and the mutant reporter vector pmiR-ERK1-mut 3?UTR were successfully constructed.The rno-miR-15b-5p mimic decreased the activity of pmiR-ERK13?UTR plasmid(P＜0.001)but did not decrease the activity of pmiR-ERK1-mut 3?UTR plasmid.ConclusionThe recombinant pmiR-ERK13?UTR and pmiR-ERK1-mut 3?UTR plasmids were constructed successfully,and luciferase activities demonstrated that the 3?UTR ofERK1gene might be a potential target of rno-miR-15b-5p.

rno-miR-15b-5p；extracellular signal-regulated kinase 1；overlap polymerase chain reaction；pmiR-ERK13?UTR；pmiR-ERK1-mut 3?UTR；luciferase reporter assay

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.02.010

R749.4

A

1006-9771(2017)02-0166-07

2016-09-05

2016-09-18)

1.北京市自然科學基金面上項目(No.7162016)；2.國家自然科學基金面上項目(No.31271154；No.31171032)。

1.首都醫科大學基礎醫學院，北京市100069；2.黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島市266555。作者簡介：羅漢將(1990-)，男，漢族，浙江余姚市人，碩士研究生，主要研究方向：miR-15b參與抑郁癥發生的機制研究。通訊作者：楊予濤(1972-)，男，博士，副教授，主要研究方向：抑郁癥的發病機制；徐志卿(1963-)，男，博士，教授，主要研究方向：神經遞質受體和重大腦病。E-mail:yutaoy@ccmu.edu.cn(楊予濤)；zhiqingx@ccmu.edu.cn(徐志卿)。