HPV16病毒負荷量與宮頸病變及物理狀態的研究

朱義保，謝 彤，楊亮亮，萬 磊

(江西省婦幼保健院，江西南昌330006)

HPV16病毒負荷量與宮頸病變及物理狀態的研究

朱義保，謝 彤，楊亮亮，萬 磊

(江西省婦幼保健院，江西南昌330006)

目的研究HPV16病毒負荷量與宮頸病變及物理狀態的關系，探討反應宮頸病變的指標。方法收集感染HPV16患者的宮頸病變標本，對不同PML2d HPV-16質粒濃度的E2和E7基因進行定量PCR擴增，制作標準曲線，得出HPV16物理狀態的臨界值，描述標本HPV16的病毒負荷量，并根據臨界值，分析HPV16病毒負荷量與宮頸病變及物理狀態的關系。結果不同宮頸病變的HPV16中位數病毒負荷量隨宮頸病變的級別升高而增加，但病毒負荷量差異無統計學意義（P=0. 22），整合型HPV16在低級別宮頸病變也有較高分布，HPV16物理狀態在不同宮頸的分布無統計學意義（P=0.55），不同物理狀態間的病毒負荷量差異亦不顯著（P=0.34）。結論HPV16病毒負荷量與宮頸病變關系不明顯，病毒整合是宮頸病變的早期事件，高的病毒負荷量不會導致整合增加。

HPV16；病毒負荷量；宮頸病變；病毒整合

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤。流行病學資料表明，患者感染高危型HPV并整合入基因組是宮頸癌發生的必要因素，因此高危性HPV的病毒負荷量及物理狀態可能與宮頸病變的進展有關。有研究認為[1，2]，病毒負荷量高，免疫清除率低，病毒整合率高，容易導致宮頸病變，病毒負荷量與宮頸病變、病毒整合相關，但也有相反方向的報道[3]，認為病毒負荷量與宮頸病變、病毒整合無關。在本研究中，通過收集住院患者資料，對人乳頭瘤病毒HPV16進行分析，探討HPV16病毒負荷量與宮頸病變、物理狀態的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取HPV分型檢查HPV16陽性的患者，其中慢性宮頸炎21例，CINⅠ4例，CINⅡ22例，CINⅢ23例，宮頸癌28例。所有宮頸細胞標本用塑料毛刷取樣。選取的這些患者均無與宮頸病變相關的疾病。

1.2 主要試劑及儀器PML2d HPV-16質粒（P1203）由美國Addgene公司惠贈。DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR試劑、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑等購自為北京天為時代公司，ABI 7300實時熒光定量基因擴增儀為美國Applied Biosystems產品。

1.3 樣本DNA提取從宮頸管采樣，樣品分兩份，一份做人乳頭瘤病毒分型檢測，另一份備用，對于人乳頭瘤病毒分型檢測HPV16陽性的標本，取相應的備用樣品提取DNA，相關步驟參見北京天為DNA提取試劑盒。為確認樣品HPV16的感染，對提取后的DNA進行HPV16 E7基因擴增，通過凝膠電泳確認樣品存在HPV16感染。

1.4 HPV16 E2基因、E7基因、β-actin定量PCR擴增條件引物由華大基因公司合成，具體引物見表1。

表1 引物的序列及擴增條件

1.5 標準曲線的繪制提取PML2d HPV-16質粒，以103-107copies/μl的HPV16質粒為模板，對E2基因、E7基因進行定量擴增，每個濃度檢測6次，取不同批次不同濃度下E2和E7基因的CT均數，構建標準曲線。β-actin以人的基因組為模板，分別對500ng/μl、100ng/μl、20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl的基因組進行β-actin擴增，取不同濃度下的CT值，構建標準曲線。

1.6 病毒負荷量的認定及游離型和混合型HPV16的判定因樣本取樣的不同，樣本組織會呈現誤差，取樣好的標本病毒負荷量會高，取樣差的標本病毒負荷量會低，為剔除這種影響，引入β-actin內參（每個細胞的基因組含量為6.89pg），每個標本細胞的病毒負荷量為E7copy/β-actincopy；對于游離型與混合型HPV16的臨界值，取同批次不同濃度下E2/E7比值95%參考值的下限，作為區分游離型和混合型HPV16的臨界值。

1.7 統計學方法應用卡方分析和Kruskal-Wallis秩和檢驗對數據進行統計學分析。

2 結果

2.1 HPV16物理狀態的判定HPV16在游離狀態下，E2和E7的基因數相同，因此可認為E2/E7＝1是游離型，但在實際過程中，基因擴增存在一定誤差，游離狀態下的E2/E7比值會在1上下浮動，因此為剔除這種影響，我們對103~107copies/μl質粒濃度的的E2和E7基因進行6次擴增，以E2/E7比值的95%參考值的下限為臨界值，來作為判定HPV16是否為游離狀態的標準。在本研究中，我們得到30個E2/E7比值，所得值在0.76～1.24之間，95%參考值下限為0.77，因此我們以E2/E7比值0.77為界限，認為大于0.77為游離型HPV16，0和0.77之間為混合型HPV16，等于0為整合型HPV16。

2.2 病毒負荷量與宮頸病變的關系以β-actin做參比，剔除組織取樣的影響發現，隨著宮頸病變級別的增高，病毒負荷量隨之增加，慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的中位數病毒負荷量分別為6.17 copies/μl、11.22copies/μl、18.20copies/μl、23.31 copies/μl，但是分析顯示不同宮頸病變的病毒負荷量差異無統計學意義（P=0.22），宮頸病變級別高并不表示病毒負荷量高，表明病毒負荷量與宮頸病變的關系不明顯。見圖1。

圖1 病毒負荷量與宮頸病變的關系

2.3 HPV16物理狀態與宮頸病變的關系根據HPV16物理狀態的判定標準，慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的HPV16整合率隨著宮頸病變級別升高而有所增高，分別為4.00%、9.09%、13.04%、10.71%，分析顯示HPV16整合率在不同宮頸病變間的差異無統計學意義（P=0.55），表明HPV16整合與宮頸病變的關系不明顯；因混合狀態的HPV16也存在HPV16的整合，因此把混合型和整合型的HPV16合并，數據顯示慢性宮頸炎/ CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的HPV16總整合率分別為48.00%、59.09%、65.22%、75.00%，結果顯示HPV16總整合率在不同宮頸病變間分布也不顯著（P=0.23），表明HPV16總整合與宮頸病變的關系也不明顯。見表2。

表2 HPV16物理狀態與宮頸病變的關系

2.4 病毒負荷量與物理狀態的關系以往研究認為，病毒負荷量越高，病毒整合發生越多，因此本研究把病毒的物理狀態進行區別，分析不同狀態下的病毒負荷量的差異，結果發現，整合型、混合型、游離型HPV16的中位數病毒負荷量分別為17.38copies/μl、10.72copies/μl、12.30copies/μl，統計顯示不同物理狀態下的病毒負荷量差異無顯著性，不具有統計學意義（P=0.34），表明病毒負荷量的高低與病毒整合率大小關系不明顯。見圖2。

圖2 病毒負荷量與物理狀態的關系

3 討論

宮頸癌是最常見的婦女生殖系統腫瘤之一。在我國，每年新發病例約14萬，占全世界宮頸癌新發病例的29%，死亡率位居婦科腫瘤之首，嚴重威脅著廣大婦女的身心健康。目前研究發現人乳頭瘤病毒的感染(human papillomavirus，HPV)，尤其是高危型HPV的感染與宮頸癌的發生密切相關。高危型HPV通過整合入基因組，造成基因組不穩定，抑癌基因下降，癌基因過來表達而致癌，因此研究高危型HPV的病毒負荷量和物理狀態，可能與宮頸病變的發展有關。

在本研究中，我們發現與β-actin參比后，慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的中位數病毒負荷量分別為6.17copies/μl、11.22copies/μl、18.20copies/μl、23.31copies/μl，分析顯示不同宮頸病變間的病毒負荷量差異無統計學意義，我們的結果與國內的某些報道不同[4，5]，但與國外的多數報道一致[6-8]，認為病毒負荷量與宮頸病變的關系不明顯，高級別的宮頸病變不一定表示病毒負荷量高。國內的報道認為，病毒負荷量與宮頸病變相關，但查閱其報道，病毒負荷量與宮頸病變的相關系數較小，相關系數的平方決定系數更小，都在10%~20%以下，表明病毒負荷量在宮頸病變的貢獻率在10%~20%以下，所起的作用不足，容易被樣本誤差或抽樣誤差掩蓋。相反，國外報道認為，病毒負荷量與宮頸病變關系不明顯，HPV病毒負荷量的取樣只在一個時間點，時間點取樣后的病毒負荷量變化并不能知道，缺乏動態觀察，因此一個時間點的病毒負荷量不能反應其與宮頸病變的關系。而且即使動態觀察，研究發現病毒負荷量與宮頸病變之間的關系也偏低或不明顯，如Constandinou報道[9]，HPV16和HPV18動態的病毒負荷量與宮頸病變的危險度只有1.76（95%CI 1.38~2.25）和1.59（95%CI 1.25~2.03），或如Manawapat報道[10]，HPV16感染觀察一段時間后，不管是感染后清除的患者、持續進展的患者、還是CINⅢ以上的患者，病毒負荷量之間均無統計學意義，動態的病毒負荷量不能反應宮頸病變的程度。

HPV病毒整合入基因組，導致宿主基因的不穩定，激活癌基因，因此病毒的物理狀態也是考量宮頸病變的指標。但在我們的報道中，不管是HPV16純整合率還是整合型與混合型合并后的HPV16總整合率，在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的分布中均無差異，沒有統計學意義，病毒整合率和宮頸病變關系不明顯，病毒整合率沒有隨宮頸病變的級別升高而升高。在慢性宮頸炎/CINⅠ組中，HPV16就有48.00%的病毒整合率，宮頸病變早期就有HPV16整合，表明病毒整合是宮頸病變的早期事件[10-12]。

此外，亦有報道認為，病毒負荷量越多，病毒整合入基因組愈多。在我們的報道中，不同物理狀態下，整合型、混合型、游離型HPV16的中位數病毒負荷量分別為17.38copies/μl、10.72copies/μl、12.30copies/μl，分析顯示不同物理狀態下的病毒負荷量差異無統計學意義，與Cheung報道一致[13，14]，表明病毒負荷量高不一定會導致病毒整合率高。

綜上所述，我們認為HPV16病毒負荷量與宮頸病變關系不明顯，病毒負荷量高，病毒整合率不一定高，高病毒負荷量不增加病毒整合率，病毒整合率高，宮頸病變程度不一定嚴重，病毒整合是宮頸病變的早期事件。

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Analysis of HPV 16 viral load with cervical lesions and physical states

ZHU Yibao，XIE Tong，YANG Liangliang，WAN Lei. Jiangxi Maternal and Child Care Service Centre，Nanchang 330006，China.

Objective To study the correlations of HPV 16 viral load with cervical lesions and physical states，and investigate the index of cervical lesions.Methods HPV16 infected samples were collected，standard curves were made，then we analysed the HPV16 viral load，found the threshold distinguished episomal and mixed HPV16，and check the infected HPV16 states according the threshold.ResultsThe median of HPV16 viral load increased with the degree of cervical lesions，but statistical analysis showed no difference，the integration type of HPV16 also happened in low grade cervical lesions with a high frequency，HPV16 integration rates among the different cervical lesions showed no significance，and HPV16 viral load among the different physical states showed no significance too.Conclusions There was no obvious relationship between HPV16 viral load and cervical lesions，viral integration is an early event，and high viral load would not increase intergration rate.

HPV16；Viral load；Cervical lesions；Viral integration

R737.33，R446.62

A

1674-1129(2017)01-0017-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.005

2016－07－01；

2016－11－16)

1、江西省衛計委科技計劃課題（20165443）；2、江西省自然科學基金（20132BAB205003）

朱義保，男，1980年生，碩士，婦產科主治醫師，婦科腫瘤方向。

萬磊，女，1974年生，博士，婦產科主任醫師，婦科腫瘤方向，E-mail:18070393566@163.com