宜春市2011年至2012年乙型流感病毒耐藥基因分析

張紅波，莫尚鵬，陳玉紅，羅 維，熊英，李建雄，徐 燁

(1、宜春市疾病預防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民醫(yī)院，江西宜春336000)

宜春市2011年至2012年乙型流感病毒耐藥基因分析

張紅波1，莫尚鵬1，陳玉紅1，羅 維1，熊英2，李建雄2，徐 燁3

(1、宜春市疾病預防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民醫(yī)院，江西宜春336000)

目的分析宜春市2011~2012年B型流感病毒耐藥基因位點，掌握其耐藥情況，為臨床治療和疾病控制提供依據(jù)。方法采集宜春市流感監(jiān)測醫(yī)院和疑似流感疫情的流感樣病例鼻咽拭子標本進行流感病毒分離，選擇分離到的16株B型流感病毒進行核酸提取，采用逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT-PCR）擴增病毒NA基因后進行基因序列測定，用DNAStar5.0，Mage3.1生物軟件對測序結果進行分析處理，翻譯出氨基酸序列，進行基因特性分析。結果16株B型流感病毒NA區(qū)域核苷酸序列長度均為1140bp，編碼380個氨基酸，所有毒株的NA蛋白催化活性位點和輔助位點均未發(fā)生氨基酸替換。結論16株毒株均對流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物敏感，我們應該繼續(xù)對流行株耐藥情況進行檢測。

B型流感病毒；耐藥性；NA基因

流行性感冒（influenza，簡稱流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一種傳染性強、傳播速度快的疾病。其主要通過空氣中的飛沫、人與人之間的接觸或與被污染物品的接觸傳播。典型的臨床癥狀是：全身疼痛、急起高熱、乏力顯著和輕度呼吸道癥狀。乙型流行性感冒病毒是引起流感的主要病原之一，目前臨床上用于治療乙型流感的藥物僅限于神經(jīng)氨酸酶抑制劑類的藥物。本研究分析了我市2011至2012年B型流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因特征以及特異性耐藥位點，從分子水平研究我市B型流感的耐藥性特點，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源采集宜春市流感監(jiān)測哨點醫(yī)院流感樣病例或者流感疫情病例咽拭子標本。

1.2 病毒分離采用狗腎傳代細胞進行病毒分離，

根據(jù)細胞病變結合微量血凝實驗（HA）來判斷是否有病毒存在。將HA≥1：8的標本采用血凝抑制方法（HI）進行流感病毒型別鑒定（MDCK和標準血清均由國家流感中心提供）。所有被研究毒株均經(jīng)國家疾控流感中心復核（所有毒株的毒株號均下載于國家流感監(jiān)測網(wǎng)站）。

1.3 病毒選擇隨機選擇不同時間、不同監(jiān)測醫(yī)院監(jiān)測標本或疫情咽拭子標本中分離到的B型流感病毒，共16株病毒進行基因擴增和測序。

1.4 病毒RNA提取采用德國Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑對流感病毒細胞培養(yǎng)液進行核酸提取。

1.5 引物

NA-5’[2]BNAF GCAGAAGCAGAGCATATTCTTAG BNAR ATGGACAAATCCTCCCTTGATGC

以上引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成

1.6 RT-PCR擴增NA基因采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒進行RT-PCR反應，反應條件[4]：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循環(huán)如下：94℃40s，50℃40s，72℃1min 30s，35次循環(huán)，72℃10min。

1.7 核苷酸序列測定PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸雙向測定。

1.8 序列分析采用DNAStar5.0、Mage5.0分析軟件對NA-5’和NA-3’擴增的產(chǎn)物測序后核苷酸進行拼接、同時分析核苷酸和氨基酸的同源性，以B/ Beijing/1/1997的NA基因序列作為參照分析，收錄號為M54967。

2 結果

2.1 基因核苷酸同源性及遺傳進化分析16株病毒核酸經(jīng)NA5’和NA3’引物擴增后產(chǎn)物經(jīng)純化、雙向測序、序列拼接后，均獲得1140bp核苷酸，編碼380個氨基酸。經(jīng)上述軟件分析，與B/Beijing/1/ 1997進行比對，核苷酸同源性在93.7%～94.8%之間、氨基酸的同源性在92.5%～94.0%之間。在NA基因氨基酸序列的進化樹（圖1）上可見我市16株病毒同一分支上，但是這一分支又分為2個小分支，其中1個分支是是Yamagata系，另1個分支是Victoria系。

圖1 NA基因氨基酸進化樹

2.2 NA基因耐藥性位點分析根據(jù)測序的核苷酸序列推導出NA基因的氨基酸序列（圖2），對NA基因各個酶催化活性位點（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、R374）氨基酸、輔助位點（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294位）氨基酸進行分析，16株毒株全部未發(fā)生替換。對G141、N144、S249、T325、R374等其他位點進行突變分析，也未發(fā)現(xiàn)氨基酸替換的現(xiàn)象。

3 討論

乙型流感一直以來都是困擾我們的日常疾病之一，近年來的一些監(jiān)測及流行病學數(shù)據(jù)均顯示乙型流感病毒所帶來流行和死亡的疾病負擔遠遠高于人們的傳統(tǒng)認識。有研究發(fā)現(xiàn)乙型流感病毒平均發(fā)病到死亡的時間僅僅為3d，短于任何一次流感大流行時期的病例發(fā)病到死亡的時間，另外目前國內(nèi)某些藥物的不規(guī)范使用也是一個原因，人們應對乙型流感病毒予以更多的重視及關注。

從我市近年流感病毒分離情況來看，主要為甲型流感病毒，同時出現(xiàn)少量乙型流感病毒[7]，乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系共同流行。乙型流感的治療主要依賴于神經(jīng)氨酸酶抑制劑（NAIs），病毒神經(jīng)氨酸酶為藥物作用靶點，不僅因為病毒神經(jīng)氨酸酶在病毒傳播流行中發(fā)揮著重要作用，而且神經(jīng)氨酸酶的酶催化活性位點氨基酸及周圍的輔助位點氨基酸及其保守。流感病毒神經(jīng)氨酸酶主要的七個氨基酸（N2 Numbering）（R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292、R-371）作為酶催化活性位點直接作用于底物或作為維持其功能的重要因素，而其他十個氨基酸（E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、1-222、E-227、H-274、E-277、N-294）作為輔助位點，神經(jīng)氨酸酶抑制劑作用于其催化活性位點或者輔助位點[10]，可以有效阻斷流感病毒的感染、復制及傳播過程。人們對于NA抑制劑的耐藥性的研究大多數(shù)集中在甲型流感病毒，而對于乙型流感病毒相關研究進行的較少，盡管甲型流感病毒和乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶序列是不同的（一致情況僅20%~30%），但它們的活化位點的殘基及三維結構是保守的，因此神經(jīng)氨酸酶抑制劑的作用機制是相同的。

距今美國FDA批準的NAIs有Oseltamivir和Zanamivir，Oseltamivir2002年在我國注冊，隨著NAIs臨床的使用，將不可避免的出現(xiàn)耐藥株。Gubareva LV[12]等1998年報道從免疫功能低下的兒童標本中分離到在神經(jīng)氨酶酶活性位點R152K（N2 numbering）突變的對Zanamivir耐藥的乙型流感病毒；之后許多研究人員從臨床研究中發(fā)現(xiàn)分離自NAIs治療的病人標本的流感病毒出現(xiàn)D198N、I222T、H274Y、N294S位點以及E105K、G109E、E110K、S250G、G402S等其他位點的突變[13-15]，而一些監(jiān)測研究[16，17]也發(fā)現(xiàn)了流感病毒R371K、I222T、H274Y、D198E、D198Y、I222T/V位點以及R325I、G142R、N146K等其他位點的突變；而體外藥敏實驗研究[18-20]發(fā)現(xiàn)了流感病毒R152K、R292K、E119A、E119D、E119G、E119V、D198N、

I222T位點的突變會導致對NAIs的敏感性降低。這些研究都提示乙型流感NA的耐藥位點的多樣性和耐藥病毒株越來越多的涌現(xiàn)，我國在2010～2011年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4株對Oseltamivir耐藥的I222T突變株，以及1株對Oseltamivir和Zanamivir耐藥的D198N突變株[20]。

雖然本次研究尚未發(fā)現(xiàn)NA基因耐藥位點的變異，為了我市人民的身體健康，乙型流感的耐藥監(jiān)測必須長期開展下去，也為我市流感的預防和控制提供數(shù)據(jù)支持。

圖2 NA蛋白氨基酸序列

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Analysis of drug resistance gene in influenza B virus in Yichun from 2011 to 2012

ZHANG Hongbo，MO Shangpeng，CHEN Yuhong，et al.Center for Disease Control and Prevention of Yichun City，Yichun Jiangxi 336000，China.

Objective To understand the molecular characterization of neuraminidase(NA)genes and NA drug resistance of influenza B virus in YiChun from 2011 to 2012.Methods The specimens of nasopharyngeal swabs were collected from influenza like cases of monitor hospitals and influenza epidemic situation.16 strains of influenza B virus were randomly selected for detection and extract virus RNA from the specimens.Fragments of NA genes were amplified by one-step RT-PCR and then were sequenced.The data obtained were analyzed with the software DNAStar5.0 and Mage3.1.Results The nucleotides of NA gene of 16 strains were all 1140bp which encoded 380 amino acids.All strains had no mutation in catalytic residues and framework residues of NA gene.Conclusions All virus were sensitive to neuraminidase inhibitors，however continuous resistance surveillance is necessary for control and prevention influenza.

Influenza B virus；Resistance；NA gene

R446.5，Q939.92，R373.1+3

A

1674-1129(2017)01-0049-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.015

2016-07-22；

2017-01-11)

張紅波，1984年生，男，學士學位，主管技師，主要從事微生物及病毒的實驗室監(jiān)測工作

徐燁，1985年生，女，學士學位，主管技師，主要從事臨床分子分型檢測工作。E-mail：233270758@qq.com