分子印跡磁性固相萃取/液相色譜法檢測奶制品中的雙酚A

丘秀珍，黃志偉，朱惠娟，焦琳娟

(韶關學院 化學與環境工程學院，廣東 韶關 512005)

研究簡報

分子印跡磁性固相萃取/液相色譜法檢測奶制品中的雙酚A

丘秀珍*，黃志偉，朱惠娟，焦琳娟

(韶關學院 化學與環境工程學院，廣東 韶關 512005)

以雙酚A(BPA)為模板分子，磁性二氧化硅(Fe3O4@SiO2)為載體，4-乙烯基吡啶(4-VP)為功能單體，采用表面分子印跡技術制備了雙酚A磁性分子印跡聚合物微球(Fe3O4@SiO2-MIPs)。通過紅外光譜、透射電鏡等對Fe3O4@SiO2-MIPs進行了結構和形貌的表征。將制得的Fe3O4@SiO2-MIPs作為磁性吸附劑，分離富集奶制品中的BPA，建立了分子印跡磁性固相萃取/液相色譜法測定奶制品中BPA的新方法。結果表明，在優化條件下，Fe3O4@SiO2-MIPs對BPA具有良好的選擇性，最大吸附容量達13.50 mg/g，在0.05～5.0 mmol/L濃度范圍內有良好的線性關系(r2=0.993 4)，方法檢出限為0.037 μg/L，樣品加標回收率為86.2%～93.1%，相對標準偏差為2.9%～3.8%。該方法高效快速，選擇性好，可用于牛奶樣品中痕量BPA的檢測。

分子印跡聚合物；磁性固相萃??；雙酚A；高效液相色譜法

雙酚A(Bisphenol A，BPA) 是一種廣泛用于生產聚碳酸酯(PC) 、環氧樹脂(EP)、聚砜樹脂、聚苯醚樹脂等高分子材料的化工有機原料,在嬰兒奶瓶、 微波爐飯盒及其他許多食品飲料的包裝材料中均用到聚碳酸酯和環氧樹脂。研究表明，雙酚A具有雌激素的特性，故亦稱“環境荷爾蒙”，含BPA的食品會誘發嬰兒性早熟。這類物質在環境中難降解，易在生物體內蓄積，即使含量極低也能使生物內分泌失調，導致人體生殖器官異常、男性不育、乳腺癌發病率上升、雄性雌性化等病癥出現。微量甚至痕量BPA即可對動物的生理狀況、生殖系統以及胎兒發育造成不良影響[1]。目前，BPA 的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS) 及毛細管電泳法(CE) 等[2-4]。然而，實際樣品中 BPA 的含量較低，且樣品基底復雜導致干擾嚴重，很難直接檢測。因此在分析前，對目標分析物進行選擇性分離富集尤為重要。

分子印跡技術(Molecular imprinting technology，MIT)是指針對某一特定分子制備具有選擇性識別能力的聚合物的技術。由于制備的分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)具有預定性強、選擇性高、重復利用性好等優點，已廣泛應用于化學仿生傳感器[5]、天然抗體模擬[6]和化學分離[7-9]等，特別適用于從生物樣品、環境樣品以及植物等復雜體系中分離特定目標分子。目前，分子印跡技術在BPA 檢測中的應用已見報道[8]，如 Kong等[10]采用表面印跡技術克服了傳統原位聚合法中印跡孔穴“深埋”的困難，提高了 MIPs 對目標物質的傳質速率與吸附容量。但這些 MIPs 在洗脫模板和吸附過程仍需離心和過濾等繁瑣操作。磁性固相萃取(MSPE)是一種以磁性材料作吸附劑基質的一種固相萃取技術,保留了傳統固相萃取簡單、高效和有機溶劑耗量少的優點。在磁性固相萃取過程中，磁性吸附劑不是填充到吸附柱中，而是直接被添加至樣品的溶液或懸浮液中，將目標化合物吸附到分散的磁性吸附劑表面，在外部磁場作用下就可使目標化合物與樣品基質分離[11]。近年來，有研究者將磁性固相萃取技術用于樣品預處理并取得了很好的效果[12-17]。磁分離技術避免了普通固相萃取技術中操作繁瑣、吸附柱易堵塞、重復性差等問題，同時具備富集效率高、分離過程簡便等優點,因而具有很好的應用前景[10]。

本研究在磁性二氧化硅表面制備了分子印跡聚合物微球，并將其作為固相萃取的吸附劑進行樣品前處理，建立了分子印跡磁性固相萃取/液相色譜檢測奶制品中BPA的新方法。相較于其他BPA的檢測方法，該方法分離快速、簡便，回收率與靈敏度高，選擇性好，可用于樣品中痕量BPA的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A 高效液相色譜儀，配光電二極管陣列(PDA)檢測器(日本島津公司)；FTIR-Tracer 100傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)；DZF-6050D 真空干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)；HT-7700透射電子顯微鏡(日本 Hitachi公司)；MPMS XL-7振動樣品磁強計(美國Quantum公司)；EVOTGA-DSC/DT同步熱分析儀(法國塞塔拉姆有限公司)。

雙酚A、鄰苯二酚、苯酚、4-肉桂苯酚(標準品，中國生物制品藥品檢驗所)；三氯化鐵、氯化亞鐵、油酸、硅酸四乙酯(TEOS)、2,3-(環氧丙烷)丙基三甲氧基硅烷(KH 560)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮異丁腈(AIBN)均購于上海阿拉丁試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、丙酮、氯仿、乙酸、氨水均為分析純;乙腈、甲醇(色譜純，天津艾杰爾科技有限公司)；實驗用水為超純水。

1.2 雙酚A磁性分子印跡聚合物的制備

1.2.1 Fe3O4@SiO2磁性納米顆粒的合成 Fe3O4@SiO2磁性納米顆粒的合成參考文獻[11]，操作步驟如下：稱取3.975 g(0.02 mol)氯化亞鐵和9.457 g(0.035 mol)氯化鐵，分別溶于40 mL蒸餾水中。倒入500 mL三口瓶中，通氮氣30 min，氮氣氛圍下油浴60 ℃?？焖偌尤?0 mL濃氨水，加熱至80 ℃，反應1 h。滴加6 mL油酸，1 h后升溫至90 ℃，熟化30 min，加1 mol/L鹽酸。用水和乙醇分別洗滌沉淀5次，40 ℃真空干燥24 h，即得Fe3O4。稱取一定量Fe3O4微球，溶于適量甲苯，配成濃度為20 mg/mL的油基磁流體。取100 mL磁流體加入250 mL三口瓶中，加入40 mL水、160 mL異丙醇和3 mL濃氨水，電動攪拌混合，通入氮氣30 min。逐滴加入6 mL正硅酸四乙酯(TEOS)，室溫下反應24 h。反應結束后用磁鐵分離，分別用乙醇、水洗滌3次。60 ℃真空干燥24 h，即得Fe3O4@SiO2。

1.2.2 Fe3O4@SiO2硅烷化 稱取1.0 g Fe3O4@SiO2，超聲分散于20 mL DMF中，加入2 mL KH 560，在氮氣氛圍下90 ℃油浴反應12 h。反應結束后，產物依次用無水DMF、甲醇和丙酮洗滌，55 ℃真空干燥12 h。

1.2.3 Fe3O4@SiO2-MIPs磁性微球的合成 在100 mL的三頸燒瓶中加入1.0 mmol雙酚A(模板分子)、4.0 mmol 4-乙烯基吡啶(功能單體)、1.0 g烷基化的Fe3O4@SiO2和15 mL 二甲亞砜(DMSO)，超聲混合1 h。然后加入交聯劑(EDGMA，20.0 mmol)和引發劑(AIBN，50 mg)，通氮除氧15 min后，氮氣氛圍下70 ℃油浴反應24 h。反應完成后，磁分離產物。用20%乙酸甲醇溶液索氏提取，得到除去BPA的灰色粉末。將所得產物真空干燥，即得磁性雙酚A印跡聚合物(Fe3O4@SiO2-MIPs)，合成步驟見圖1。磁性非印跡聚合物(Fe3O4@SiO2-NIPs)的制備與Fe3O4@SiO2-MIPs相同，只是不加模板分子BPA。

圖1 雙酚A分子印跡磁性微球的合成示意圖Fig.1 Schematic of the preparation of BPA magnetic molecularly imprinted microsphere

1.3 MIPs磁性微球的吸附性能研究

準確量取10 mL 0.2 mmol/L雙酚A溶液置于圓底燒瓶中，分別加入20.0 mg的Fe3O4@SiO2-MIPs和Fe3O4@SiO2-NIPs磁性微球。室溫下轉速為200 r/min振蕩吸附120 min，每隔15 min磁性分離，取上層清液進HPLC測定溶液中剩余的雙酚A濃度，按公式(1)計算吸附容量：

(1)

式中c0(mmol/L)和ce(mmol/L)分別為標準溶液的初始濃度和平衡吸附濃度，M為摩爾質量，V(mL)和W(g)分別是吸附溶液的體積和MIPs的質量。吸附后的Fe3O4@SiO2-MIPs加入10 mL 20%的乙酸甲醇溶液去除模板分子雙酚A，再用純甲醇洗滌數次干燥后重新使用。相同方法研究Fe3O4@SiO2-MIPs的靜態吸附性能、選擇性和重復利用性能等。

1.4 樣品前處理方法

取2 mL純牛奶，加入5 mL乙腈，振蕩混合1 min，以4 000 r/min轉速離心20 min，取上層清液，準確加入20.0 mg Fe3O4@SiO2-MIPs磁性微球，室溫下振蕩萃取30 min后，用磁鐵磁性分離，取上清液供HPLC測定。

1.5 色譜條件

Dikma Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)，流動相：乙腈-水(50∶50)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：279 nm。

圖2 Fe3O4@SiO2(a),Fe3O4@SiO2-KH 560(b)和Fe3O4@SiO2-MIPs(c)的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of Fe3O4@SiO2(a),Fe3O4@SiO2-KH 560(b) and Fe3O4@SiO2-MIPs(c)

圖3 Fe3O4@SiO2-MIPs(a)和Fe3O4(b)的熱重分析曲線Fig.3 TGA curves of Fe3O4@SiO2-MIPs(a) and Fe3O4(b)

2 結果與討論

2.1 MIPs磁性微球的表征

2.1.2 熱重分析 圖3為Fe3O4和Fe3O4@SiO2-MIPs的TGA曲線，其中曲線a顯示Fe3O4@SiO2-MIPs在205 ℃和 344 ℃之間有一快速失重的階段，這是源于Fe3O4@SiO2的表面分子印跡聚合物。該結果說明Fe3O4@SiO2表面已成功聚合了MIPs涂層。

2.1.3 TEM表征 采用TEM表征Fe3O4@SiO2-MIPs微球的形貌特征，由圖4A可以看出，通過共沉淀法合成的Fe3O4@SiO2納米顆粒展現出均一的球形，顆粒大小約為100 nm。圖4B顯示經過硅膠表面修飾后接枝MIPs層后，Fe3O4@SiO2外層包覆了MIPs涂層。根據TEM圖像計算，MIPs涂層的平均厚度約為20 nm，而薄的MIPs層更有利于傳質和結合。

2.2 Fe3O4@SiO2-MIPs磁性微球的吸附性能分析

圖5 Fe3O4@SiO2-MIPs 和 Fe3O4@SiO2-NIPs的吸附動力學曲線Fig.5 Adsorption kinetic curves of Fe3O4@SiO2-MIPs and Fe3O4@SiO2-NIPs for BPA

2.2.1 Fe3O4@SiO2-MIPs的動態吸附實驗 比較了Fe3O4@SiO2-MIPs和Fe3O4@SiO2-NIPs的動力學吸附曲線(圖5)。在0～45 min 范圍內，Fe3O4@SiO2-MIPs的吸附容量隨時間的變化增長較快，45 min后吸附容量變化緩慢，基本達到吸附平衡；而Fe3O4@SiO2-NIPs的吸附容量隨時間的變化增長較慢，吸附容量較小。故選定45 min為后續磁性固相萃取的最佳吸附時間。

圖6 Fe3O4@SiO2-MIPs和Fe3O4@SiO2-NIPs的平衡吸附曲線Fig.6 Adsorption isotherms of Fe3O4@SiO2-MIPs and Fe3O4@SiO2-NIPs for BPA

2.2.2 Fe3O4@SiO2-MIPs的平衡吸附實驗 圖6為Fe3O4@SiO2-NIPs和Fe3O4@SiO2-MIPs 對BPA的吸附等溫線。通過Langmuir方程擬合實驗數據，Fe3O4@SiO2-MIPs和Fe3O4@SiO2-NIPs對BPA的飽和容量分別為13.5 mg/g和1.6 mg/g。Fe3O4@SiO2-MIPs的吸附容量遠高于Fe3O4@SiO2-NIPs，前者的吸附量約為后者的8.5倍。表明Fe3O4@SiO2-MIPs微球表面比Fe3O4@SiO2-NIPs具有較多的BPA分子印跡空穴，對BPA具有更優異的選擇性識別能力。

2.2.3 Fe3O4@SiO2-MIPs磁性微球的選擇性 為了考察Fe3O4@SiO2-MIPs對BPA的選擇性能，本文選取4-肉桂苯酚、苯酚、鄰苯二酚3種結構類似物作競爭底物。配制0.2 mmol/L的BPA及其結構類似物的混合溶液，加入50.0 mg的Fe3O4@SiO2-MIPs，置于恒溫搖床中，室溫下轉速為200 r/min振蕩吸附90 min。然后磁性分離，取上清液用HPLC測定各物質的剩余濃度，按公式(1)計算吸附容量。

圖7 BPA及其類似物的吸附性能Fig.7 Adsorption performances of BPA and its analogues

圖8 加標樣品經Fe3O4@SiO2-MIPs吸附前后的色譜圖Fig.8 Chromatograms of BPA obtained from milk sample before and after Fe3O4@SiO2-MIPs extraction a.4-cumylphenol(4-叔丁基苯酚)；b.phenol(苯酚)；c.catechol(鄰苯二酚)

結果顯示，Fe3O4@SiO2-MIPs對BPA的吸附容量明顯高于4-肉桂苯酚、苯酚和鄰苯二酚3種結構類似物，且4-肉桂苯酚與BPA的結構相似度大于苯酚、鄰苯二酚，吸附容量也高于其他兩種類似物(圖7)，這說明Fe3O4@SiO2-MIP對BPA的高選擇性主要源于其MIPs空穴。Fe3O4@SiO2-NIPs對BPA及其3種類似物的吸附量相近，說明Fe3O4@SiO2-NIPs對BPA無選擇性。

2.2.4 Fe3O4@SiO2-MIPs的吸附重現性 為了考察Fe3O4@SiO2-MIPs的重復利用率，本文采用Fe3O4@SiO2-MIPs對0.2 mmol/L的BPA溶液進行6次吸附-解吸附循環試驗。結果顯示，經過6次循環吸附試驗，Fe3O4@SiO2-MIPs的吸附效率只降低5.3%，說明其具有良好的重復利用性能。

2.3 牛奶中BPA的磁性分離與分析

為了考察Fe3O4@SiO2-MIPs在實際樣品中的應用分析能力，本文采用Fe3O4@SiO2-MIPs對一系列不同濃度的加標牛奶樣品進行測試。將20 mg Fe3O4@SiO2-MIPs作為分子印跡磁固相萃取吸附劑對實際樣品中的BPA進行分離富集，然后用HPLC/PDA對BPA進行檢測。結果表明，在0.05～5.0 mmol/L濃度范圍內，BPA具有良好的線性關系，相關系數(r2)為0.993 4。加標牛奶樣品經Fe3O4@SiO2-MIPs吸附處理后的色譜圖，雜質峰明顯減少(圖8)。該方法對BPA的檢出限(S/N<3)為0.037 μg/L，低于大部分已報道的BPA檢測方法。通過對高、中、低3個不同濃度的加標牛奶樣品進行回收率測定，測得BPA在1.0，10.0,100.0 μmol/L加標水平下的加標回收率分別為86.2%，93.1%，91.2%，相對標準偏差分別為3.2%，3.8%，2.9%。說明該方法可用于牛奶樣品中痕量BPA的檢測。

3 結 論

本文建立了一種新的磁性分子印跡聚合物應用于BPA的選擇性分離檢測的方法。利用分子印跡技術在磁性納米粒子的表面修飾上一層薄而均勻的分子印跡涂層，所合成的Fe3O4@SiO2-MIPs對BPA具有很高的吸附量，專一性的識別能力，并且具有良好的重現性。該方法已成功應用于牛奶樣品中BPA含量的分析檢測。

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Determination of Bisphenol A in Milk Sample Using Magnetic Molecularly Imprinted Polymers Solid-phase Extraction Combined with High Performance Liquid Chromatography

QIU Xiu-zhen*,HUANG Zhi-wei,ZHU Hui-juan,JIAO Lin-juan

(College of Chemistry and Environmental Engineering,Shaoguan University,Shaoguan 512005,China)

A new magnetic molecularly imprinted polymers(MIPs) were prepared by using Fe3O4@SiO2as the support,4-vinyl pyridine(4-VP) as functional monomer,bisphenol A(BPA) as template molecule through surface molecularly imprinted polymerization technology.The structure and morphology of Fe3O4@SiO2-MIPs were characterized by infrared spectroscopy(IR)and transmission electron microscopy(TEM).A new method was established for the separation and enrichment of BPA in milk sample by molecularly imprinted magnetic solid-phase extraction combined with high performance liquid chromatography(HPLC) using Fe3O4@SiO2-MIPs as magnetic adsorbent.The results showed that the Fe3O4@SiO2-MIPs has a high selectivity for BPA under the optimized experimental condition,and the adsorption capacity of Fe3O4@SiO2-MIPs was 13.50 mg/g.The calibration curve of BPA was linear in the range of 0.05-5.0 mmol/L with a correlation coefficient(r2) of 0.993 4.The limit of detection(LOD) was as low as 0.037 μg/L.The proposed method was successfully applied in the determination of BPA in milk sample,with average recoveries of 86.2%-93.1%and relative standard deviations(RSDs) of 2.9%-3.8%at three spiked levels.The developed method is rapid and selective,and is adaptable to the analysis of trace BPA in milk sample.

molecular imprinted polymers;magnetic solid-phase extraction;bisphenol A;high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-08-20；

2016-09-21

廣東省自然科學基金項目(2014A030307024)；2015年廣東省大學生創新創業立項項目(201510576042)；2016年廣東大學生科技創新培育專項資金(pdjh2016b0458)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.014

O657.72;O625.31

A

1004-4957(2017)02-0236-06

*通訊作者：丘秀珍，碩士，副教授，研究方向：復雜體系分離分析，Tel：0751-8120118，E-mail:Gold0226@126.com