滇桂艾納香多糖的分離純化及單糖組成分析

許子競(jìng)+劉茜

摘要以滇桂艾納香干燥全草為原料，以水為溶劑提取多糖BRP，經(jīng)過D101大孔樹脂脫色，DEAE纖維素柱分離，依次用水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，得BRP0，BRP1.5，BRP3和BRP4四個(gè)洗脫部分；將BRP0，BRP1.5采用Sevage法脫蛋白、活水透析和Sephadex G15柱層析，再經(jīng)瓊脂糖Sepharose 6FF柱層析分離純化，得到BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54五個(gè)組份；GPC檢測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量、分子質(zhì)量分布及峰型，確定它們?yōu)榫唤M分多糖；HPLC分析結(jié)果顯示，BRP0和BRP1.5主要由鼠李糖、果糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量之比大致為：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

關(guān)鍵詞滇桂艾納香多糖；DEAE纖維素分離；凝膠色譜純化；HPGPC檢測(cè)；單糖分析

中圖分類號(hào)R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537（2017）01006506

滇桂艾納香（Blumea riparia （BL.） DC）為菊科艾納香屬植物的干燥全草，又名假東風(fēng)草，多見于云南和廣西交接部，生于山草坡地或灌木叢中[1]，其味甘、溫、無毒，具有活血散瘀、祛風(fēng)除濕、利水作用，在廣西民間有幾百年的藥用歷史，常用于婦女經(jīng)期提前、產(chǎn)后血崩、浮腫、骨痛、受涼腹痛、腹瀉等多種婦科常見疾病的防治[2].以滇桂艾納香為原料的乙醇溶液提取物制成的中成藥——婦血康顆粒，已用于臨床，療效顯著；研究表明，其水提取物也具有顯著的止血活性功效[34]，但是其有效成分及其含量、藥理作用均不是非常明確；因此，本文對(duì)其水提多糖（Blumea riparia Polysaccharides， abbreviated as BRP）成分進(jìn)行提純，并對(duì)多糖的組分進(jìn)行分析[56]，為進(jìn)一步研究婦血康顆粒制劑的藥理和作用機(jī)制打下基礎(chǔ).

1儀器與方法

1.1材料與設(shè)備

滇桂艾納香干燥全草，廣西桂西制藥有限公司；DEAE纖維素，上海恒信化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G15和Sepharose 6FF 生化試劑，南京森貝伽生物科技公司；葡萄糖（AR），上海醫(yī)藥公司；果糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸（生化試劑），上海伯奧生物科技有限公司；RC451k透析袋，上海綠島科技發(fā)展有公司；硫酸、苯酚、無水乙醇、丙酮等均為國產(chǎn)AR試劑.

Nexus 470型FTIR紅外分光光譜儀（Nicole，America）；Agilent 1260高效液相色譜儀（America）；Agilent Technotgies 1200 GPC System（America）；UV265FW紫外可見分光光度計(jì)（Shimadzu Japan）；DZF6020真空干燥箱（河南鞏義科技儀器公司）；ALPHAL型真空冷凍干燥機(jī)（Germany）.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1滇桂艾納香干燥全草多糖BRP的提取、分離、純化

（1） 提取取滇桂艾納香干燥全草5 kg，粉碎，過282 μm篩，稱其碎片3.0 kg，加無水乙醇回流提取多次，除去脂溶性成分，藥渣以蒸餾水為溶劑，用微波提取器（1 kW，10 L）在85 ℃下提取3次，每次20 min；提取液離心去雜、減壓濃縮約至原體積的1/5，加乙醇至含醇80%左右，冰浴放置過夜，離心，得BRP沉淀物.BRP用無水乙醇多次浸提，去除殘余脂溶性物質(zhì)和部分色素.

（2） 脫色將上述BRP配成稀水溶液，直至沉淀物不再溶解，過濾，取濾液過D101大孔樹脂，用水洗脫，直至洗脫液顏色淺淡，收集水洗脫液，濃縮[7].

（3） 分離將上述濃縮液進(jìn)行DEAE纖維素柱層析[89]，依次用蒸餾水和0.15，0.30，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，用苯酚硫酸顯色檢測(cè)，收集各梯度洗脫液.

（4） 脫蛋白對(duì)各收集液采用Sevage法（V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1）多次脫蛋白至紫外260～280 nm處無明顯吸收峰為止[10].

（5） 透析脫蛋白后的BRP溶液裝入GRC451k透析袋內(nèi)，活水透析72 h以上.

（6） 脫鹽透析后的BRP溶液過Sephadex G15柱層析，脫除BRP溶液中殘留的鹽，收集BRP溶液.

（7） 凝膠純化將透析的BRP0和BRP1.5溶液濃縮，過0.45 μm微孔濾膜，經(jīng)瓊脂糖凝膠Sepharose 6FF層析，蒸餾水洗脫，自動(dòng)部分收集器收集，苯酚硫酸顯色檢測(cè)，繪制洗脫曲線，根據(jù)峰型合并各洗脫部分，冷凍干燥，得BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54五個(gè)組分.

1.2.2BRP性質(zhì)表征

（1） BRP相對(duì)分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布測(cè)定采用凝膠滲透色譜法，Agilent 1260HPLC儀，柱型為PL.AqnagelOH（300 mm×7.8 mm），柱溫，35 ℃；流動(dòng)相：0.05 mol/L H3PO4Na2HPO4緩沖液（pH6.7，加0.05%NaN3）；流速：1.0 mL/min；示差折光檢測(cè)，進(jìn)樣體積20 μL；以T系列葡聚糖T1，T3，T5，T7，T9，T11和T13為標(biāo)樣對(duì)照.

（2） BRP的酸水解分別取50 mg BRP01和BRP1.5置于安培管中， 加入6 mL 2 mol/L H2SO4，在油浴中保持110 ℃恒溫加熱8 h，水解液用BaCO3粉末中和除酸，離心，將上清液濃縮，定容至2 mL，供HPLC分析.

（3） BRP紅外光譜分析取微量BRP樣品，拌KBr研磨壓片，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描檢測(cè)基團(tuán)吸收峰類型.

（4） BRP單糖組成分析色譜條件：Kromasil NH2色譜柱（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈水（體積比為80∶20）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min，示差折光檢測(cè)；進(jìn)樣量：20 μL[1112].

2結(jié)果與分析

2.1BRP蛋白含量檢測(cè)

BRP經(jīng)紫外光譜掃描檢測(cè)， 如圖1所示，260～280 nm處幾乎無紫外吸收峰，表明多糖中蛋白、多肽及核酸幾乎脫除完全，達(dá)到分離純化要求.

2.2DEAE纖維素對(duì)BRP的分離

BRP溶液經(jīng)DEAE纖維素層析柱分離，分別用蒸餾水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，收集部分分別命名BRP0，BRP1.5，BRP3和BRP4.5，其洗脫曲線見圖2.由于BRP3和BRP4.5組分還含少量難除色素，所以只對(duì)BRP0和BRP1.5進(jìn)一步分離純化研究.

2.3BRP0進(jìn)一步純化

將BRP0配成適當(dāng)濃度溶液，經(jīng)瓊脂糖凝膠Sepharose 6FF柱層析純化分離，蒸餾水洗脫，BRP0的洗脫曲線如圖3所示，所得多糖命名BRP01.

2.4BRP1.5進(jìn)一步純化

將BRP1.5上Sepharose 6 FF層析洗脫，得4個(gè)洗脫組分，分別命名為BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54，洗脫曲線如圖4所示.

2.5BRP純化組分分子量及分子量分布測(cè)定

采用凝膠滲透色譜法（GPC 法）測(cè)定多糖BRP的相對(duì)分子質(zhì)量（M）[13]，BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54各組分分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布測(cè)定和純度如圖5～6所示.

由表1可見，多糖組分BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54的重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為1 394，11 754，8 319，7 208和5 936，分散系數(shù)分別為1.035，1.053，1.099，1.091和1081，這些組分均由單一色譜峰組成，峰型尖銳均勻?qū)ΨQ，表明它們是均一組分多糖.

2.6BRP的紅外光譜圖

BRP紅外光譜各吸收峰如圖7所示，其對(duì)應(yīng)基團(tuán)振動(dòng)類型如表2，從表2可知，波數(shù)1 616.82 cm-1處是〖KG-*2〗〖JG（〗C〖ZJLX，Y〗O〖JG）〗〖KG-1*2〗伸縮振動(dòng)吸收峰，表明多糖BRP含有醛糖酸[14].

2.7BRP1.5的HPLC分析

HPLC對(duì)水解后的BRP多糖與單糖對(duì)照品對(duì)照，分析其單糖組成[15]，見圖8～9所示.結(jié)果表明，BRP0和BRP1.5除含少量半乳糖醛酸外，主要由鼠李糖、果糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量之比大致為：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

3結(jié)論

滇桂艾納香干燥全草提取得粗多糖BRP，經(jīng)DEAE纖維素層析分離得到BRP0，BRP1.5，BRP3和 BRP4.5，進(jìn)一步將BRP0和BRP1.5純化后獲得BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54組分，經(jīng)HPGPC檢測(cè)，它們?yōu)榫环肿佣嗵牵渲鼐鄬?duì)分子質(zhì)量分別為1 394，11 754，8 319，7 208和5 936，分散系數(shù)分別為1.035，1.053，1.099，1.091和1.081，說明其分子質(zhì)量分布均一.通過HPLC分析，BRP0和BRP1.5主要由鼠李糖、果糖、半乳糖組成， 其單糖物質(zhì)的量之比大致為：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

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