果樹細胞懸浮培養研究進展

李海英++邵靜++張學明++鄭亞杰

摘 要：植物細胞懸浮培養是一種新型的培養技術，在育種、生產次生代謝產物和生物工程中，具有廣泛的應用。本文主要分析了植物細胞懸浮培養主要影響因素，并綜述了果樹方面的研究概況，討論了今后發展前景。

關鍵詞：果樹；懸浮細胞；培養；研究進展

中圖分類號：Q31 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170133039

1 果樹細胞懸浮培養研究概況

植物細胞懸浮培養最初用于草本植物，直到20世紀90年代初，學界才在木本植物中應用的研究報道。例如，利用懸浮培養中國小葉楊，成功獲得了懸浮細胞系并得到再生植株。

1.1 懸浮培養體系建立方面

自1954年Muir等第1次進行植物細胞懸浮培養以來，國內外在此方面已經取得了很大進展。Dheda等成功地由煮食蕉 Bluggoe（ Musa spp. ABB）建立起胚性細胞懸浮系，并通過體胚發生途徑獲得再生植株。張進仁等以錦橙試管苗下胚軸切段誘導愈傷組織，首次用細胞懸浮培養方法獲得柑桔植株。陳崇順對杏細胞懸浮培養進行了研究，結果表明，選用未木質化的外植體，提高培養基中Ca（N03）2 、2，4-D和激動素的濃度，增加繼代培養次數，能快速得到100% 的脆散型愈傷組織，成功地建立其細胞懸浮培養系統。周玉萍等以基因型不同的香蕉、大蕉和粉蕉吸芽莖尖培養產生的分生芽為外植體，不經過愈傷組織階段直接由莖尖分生細胞，得到許多成分單一、分裂能力強大的胚性細胞懸浮系。BLANDO 等和INFANTE利用懸浮細胞培養技術，來培養森林草莓葉片愈傷組織，首次獲得了再生植株。

1.2 果樹育種方面

目前，植物細胞懸浮培養育種方式，已經在國內外得到推廣和應用。鮑雷珍、李佩芬等以葡萄花絲為材料懸浮培養后，用秋水仙素進行誘變處理獲得了變異體（同質變異體）植株。徐春香等采用農桿菌介導法，將香蕉抗凍蛋白AFP基因，轉入胚型懸浮細胞系中，成功獲得轉基因植株。

1.3 次生代謝物培養方面

懸浮體系在植物次生代謝物規模化培養中應用非常多，但在果樹方面的應用還較少。龍小鳳等以巨峰葡萄果皮作為外植體，通過研究，發現暗培養下的愈傷組織更適合懸浮培養，利用這種培養方式，白藜蘆醇產量可達3.38 mg/L。曲均革等利用葡萄細胞懸浮培養生產次生代謝物花青素的研究取得了一些進展，認為接種量為1.60g 時，經過7d 繼代周期培養條件下花青素合成相對穩定。

2 果樹細胞懸浮培養過程中的主要影響因素

2.1 愈傷組織的狀態

愈傷組織狀態如何，對細胞懸浮系的穩定情況具有重要影響。愈傷組織可分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。研究表明，只有胚性愈傷組織能成功建立胚性細胞懸浮系。張進仁等對幼嫩新鮮愈傷組織進行繼代培養，結果發現該愈傷組織生長快、繁殖系數高，能夠較好地用于建立懸浮培養細胞系。

2.2 細胞懸浮培養初始密度

細胞在進行分裂和生長的時候，需要其內源代謝物質達到一定的閥值，只有在細胞初始密度與營養物比例合理，培養效果才能達到理想狀態。周春江等對草莓懸浮細胞培養的研究表明，體積為40mL的懸浮細胞培養液，以4～6 mL接種量為宜。程江華在150mL三角瓶中加入25mL培養基，當接種量為3g鮮重時，石榴細胞增殖速度快，增值倍數可達2.83倍，且細胞生長狀態、分散性都比較好，但當接種量小于2g/25mL時，細胞生長速度就會趨緩，而在大于4g/25mL時，不僅細胞生長速度減緩，還會出現褐化現象。

2.3 搖床轉速

由于植物細胞體積大，細胞壁主要由纖維素組成，液泡占到95 % 以上，對剪切力比較敏感，因而必須要控制好搖床的轉速，一般控制在90～120r/min內為宜 。但涂藝聲等認為草珊瑚的懸浮培養物最佳的搖床轉速為40r/min，在100r/min 速度下振蕩培養幾乎難以存活。

2.4 激素濃度

在細胞懸浮培養過程中，激素是調控細胞狀態的重要因素。倪建偉等以野生唐古特白刺為外植體進行研究，發現激素2，4-D是影響愈傷組織相對生長量和形態的主要影響因子。王巍巍等在沙棗細胞懸浮培養試驗中，發現激素組合對沙棗細胞生長影響很大，尤其是附加 BA 0.1mg/L和 TDZ 0.1mg/L組合的NT液體培養基，細胞增長系數達到5.73。陳崇順等通過對誘導杏的莖段愈傷組織進行研究，發現2，4-D是組織形成、生長必需的。不過，杏的品種不同，對2，4-D的濃度敏感性也存在差異。魏岳榮等以貢蕉 （AA）未成熟雄花序為外植體，建立胚性細胞懸浮系，結果表明，9μmol /L 2，4-D對外植體愈傷組織的誘導效果最佳，誘導率為40.96% ，胚性愈傷組織誘導率可達7.45 %。

2.5 蔗糖濃度

蔗糖是植物賴以生長的重要碳源，也是滲透壓調節劑，對植物具有重要作用。張潔在草莓懸浮培養中發現，在 0～30g/L 時，細胞增殖倍數隨著蔗糖濃度增加而上升，30g/L時細胞的增殖倍數達到最大，而超過60g/L的時候，細胞增殖倍數就會顯著降低。杜曉映認為，合適的蔗糖濃度為30g/L。

2.6 有機附加物

木本植物組織和細胞培養以無機氮為主，有時輔以有機氮源，氨基酸是常用的有機氮源之一。在禾本科植物胚性細胞懸浮系的建立中，已對椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白等的作用進行了研究，多數結果表明，有機添加物能促進胚性細胞懸浮培養物的增殖、生長，提高其胚胎發生能力。在M1培養基中加入酪蛋白和脯氨酸，將有利于胚性愈傷組織的誘導。

2.7 繼代周期

繼代周期的長短和換液比例，會影響懸浮細胞的生長狀態。如果繼代周期短，將會降低細胞生長速度，反之，則會因細胞液泡變大，而導致懸浮細胞極度“饑餓”。陳崇順等根據杏細胞懸浮培養結果，認為增加繼代培養次數，將會有效提高愈傷組織的脆散性，達到5次時，具有高脆散性愈傷組織的比例可達90% 以上。

3 發展前景

根據植物細胞懸浮系自身的特點，可以用于生產次生代謝物，此類研究在中藥方面比較普遍，在果樹方面的報道還很少，具有很大開發潛力。此外，可以廣泛應用到果樹育種中：直接用于原生質體分離、培養與雜交。根據已有報道，將愈傷組織懸浮細胞系或胚性懸浮系作為分離原生質體的起始材料，原生質體的產量和活力都比較高，培養也更容易。而原生質體能克服性細胞不親和障礙，實現遠緣的體細胞雜交；用于基因轉移。通過引入外源基因，增強植物抗病毒、抗蟲、抗逆、抗除草劑、改良果實品質等能力；篩選突變體。用誘變劑直接處理懸浮培養的單細胞和原生質體，篩選所需要的突變體，是直接獲得同質突變體的最理想方法。細胞懸浮培養技術對果樹品種改良，具有關鍵作用，發展前景比較廣闊，如何在實踐中，成功應用此項技術，是我國育種工作者在今后的育種研究中重點探索的內容之一。

參考文獻

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[3]謝華永.楊樹胚性懸浮細胞系建立與原生質體融合研究[D].南京林業大學碩士學位論文，2004.

作者簡介：鄭亞杰（1960-），女，遼寧省開原市，本科，研究員，果樹遺傳育種與栽培技術。