2型糖尿病并發肺結核患者血清中炎癥細胞因子水平變化的研究

李雨澤 劉玉琴 陳向麗 侯紹英 Hayder 姜輝 李殿忠

·論著·

2型糖尿病并發肺結核患者血清中炎癥細胞因子水平變化的研究

李雨澤 劉玉琴 陳向麗 侯紹英 Hayder 姜輝 李殿忠

目的 探討2型糖尿病并發肺結核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)患者血清中炎癥細胞因子Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)和脂多糖受體14(lipopolysaccharide receptor 14，LPS受體14；又稱CD14)水平的變化。方法 選取2014年9月至2015年6月在黑龍江省傳染病防治院就診的T2DMTB患者40例(T2DMTB組)，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者40例(T2DM組)，以及體檢科篩查出的健康者40名(對照組)作為研究對象。收集研究對象的人口學特征資料，并抽取清晨空腹靜脈血3～4 ml。采用酶聯免疫吸附試驗檢測研究對象血清中TLR4和CD14的水平，并進行比較。結果 對照組、T2DM組和T2DMTB組血清中TLR4水平分別為(10.21±2.29) ng/ml、(19.40±1.80) ng/ml、(15.27±2.52) ng/ml，三組間比較差異有統計學意義(F=76.33，P<0.01)；進一步的兩兩比較顯示，T2DM組和T2DMTB組均高于對照組，T2DMTB組低于T2DM組，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。對照組、T2DM組和T2DMTB組血清中CD14水平分別為(9.17±1.62) ng/ml、(16.48±1.54) ng/ml、(10.86±1.65) ng/ml，三組間比較差異有統計學意義(F=113.92，P<0.01)；進一步的兩兩比較顯示，T2DM組和T2DMTB組均高于對照組，T2DMTB組低于T2DM組，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。結論 T2DMTB組血清中TLR4和CD14水平高于對照組，而低于T2DM組；T2DMTB患者血清中TLR4和CD14水平變化，對T2DMTB的發病機制有提示作用。

結核； 肺； 糖尿病，2型； 炎癥趨化因子類； 評價研究

結核病是嚴重危害公眾健康的公共衛生問題，我國結核病負擔很重，全國≥15歲人口中活動性肺結核患者預計可高達499萬例[1]。文獻報道顯示，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者較正常人更容易患肺結核[2]。2型糖尿病并發肺結核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)患者多表現為肺部病變重、病情進展快、原發耐藥多和預后差。因此，探索T2DMTB的發病機制，尋找T2DM患者中肺結核高危人群，進而早期預防與治療已成為亟待解決的問題。目前認為，T2DM是一個慢性炎癥的病理過程[3-4]，而肺結核也是公認的慢性感染性疾病。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是機體天然免疫屏障中作用機制最明確的Toll樣家族相關受體，可在包括巨噬細胞、樹突狀細胞及胰島細胞等在內的免疫和非免疫細胞中表達，并在天然免疫防御中發揮關鍵作用[5-6]。此外，當病原體入侵機體時，機體最先識別的就是病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，而脂多糖受體14(lipopolysaccharide receptor 14，LPS受體14；又稱CD14)已被證實可以使TLR4與PAMP的親和力增強，從而同樣發揮免疫防御作用[7-8]。TLR4、CD14水平的改變與健康人群T2DM[9-10]或肺結核[11-12]患病相關，但T2DMTB患者這些炎癥細胞因子水平改變的情況尚不明確。因此，筆者選取我國東北地區的漢族人群(人群限定是為后續基因測序做準備)，比較T2DM、T2DMTB及健康人群血清中炎癥細胞因子TLR4、CD14水平，探討血清炎癥細胞因子水平的改變與T2DMTB發病的關聯。

對象和方法

1.對象：選取2014年9月至2015年6月在黑龍江省傳染病防治院就診的T2DMTB患者40例(T2DMTB組)，T2DM患者40例(T2DM組)，以及體檢科篩查出的健康者40名(對照組)作為研究對象。收集研究對象人口學特征及相關臨床檢測指標。研究對象均抽取清晨空腹靜脈血3～4 ml (使用乙二胺四乙酸抗凝)，分離血清，-20 ℃保存待測。本研究經過黑龍江省第四醫院倫理委員會的審核，研究對象均簽署知情同意書。

2.納入標準：所有研究對象均為中國黑龍江省漢族人群(限定“民族”為后續基因多態性研究做準備)，民族判定以現場家族史詢問及身份證為準。(1)T2DMTB組：研究對象為已患T2DM且初次診斷為并發肺結核患者，其符合T2DM和肺結核的診斷標準。T2DM的診斷參照文獻[13]，即有明顯的糖尿病典型癥狀(包括多飲、多食、多尿、體質量下降)，并滿足以下任意一條件：①任意時間血糖≥11.1 mmol/L；②空腹血糖≥7.0 mmol/L；③空腹血糖≥7.0 mmol/L且口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)2 h血糖≥11.1 mmol/L。肺結核診斷參照文獻[14]。(2)T2DM組：研究對象符合T2DM診斷標準[13]，且根據肺結核診斷標準[14]確定未患肺結核者。(3)對照組：研究對象為無肺結核既往史、無糖尿病家族史，生化全項、血常規、糖化血紅蛋白、尿常規、尿微量白蛋白等檢查均正常的健康人群。

3.排除標準：并發艾滋病、病毒性肝炎(乙型和丙型)、梅毒、腫瘤、結締組織病及其他內分泌疾病的患者；非中國黑龍江省漢族人群。

4.細胞因子水平測定：血清中TLR4和CD14采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進行測定，所用試劑盒均購自北京誠林生物制品有限公司。不同批次試劑盒無交叉使用。每次實驗標準品線性回歸與預期濃度相關系數R2均大于 0.99。實驗進行2次，取平均值。

結 果

1.基本信息：對照組、T2DM組和T2DMTB組間研究對象在性別、年齡及身高方面的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 研究對象人口學特征在各組間分布情況

2.細胞因子水平：經ELISA檢測研究對象血清中TLR4水平，對照組、T2DM組和T2DMTB組間差異有統計學意義；血清中CD14水平，3組間差異也有統計學意義(表2)。進一步的組間兩兩比較顯示，血清TLR4水平T2DM組和T2DMTB組均高于對照組，T2DMTB組低于T2DM組，差異均具有統計學意義(P值均<0.01)；血清CD14水平，T2DM組和T2DMTB組均高于對照組，T2DMTB組低于T2DM組，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。

表2 各組研究對象血清TLR4和CD14受體水平

討 論

病原體微生物中具有的結構恒定又進化比較保守的分子結構被定義為PAMP。PAMP包括LPS、蛋白聚糖(proteoglycan，PG)、脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)等。TLR4識別結核分枝桿菌病原體細胞壁LAM后觸發各種細胞內信號轉導通路[15]，最終導致機體產生天然免疫。CD14參與并增強了TLR4的識別和再結合結核分枝桿菌的能力。所以，研究TLR4及CD14與T2DMTB發病的關系有著非常重要的意義。

本次研究中，各組研究對象年齡、性別、身高間差異無統計學意義，減少了混雜因素。各組研究對象血清中TLR4水平從低到高依次為對照組、T2DMTB組及T2DM，其中，T2DM組高于對照組和T2DMTB組，T2DMTB組高于對照組。各組血清中CD14水平也具有相同的趨勢。T2DM組血清中TLR4及CD14水平均高于對照組也進一步證明了T2DM本身就是慢性炎癥過程。炎性反應可以使得Toll樣受體下游核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)被激活，其活化后又可促進腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)轉錄，加劇包含胰島細胞在內的氧化應激，導致T2DM的發生[16]。本結果也與一些其他研究報道一致。Singh等[17]研究發現，T2DM患者血清中LPS及TLR4均有升高；楊孟雪等[18]發現，肥胖糖尿病患者血清中TLR4升高，而且NF-κB被激活，為正反饋炎性反應過程。

TLR4是Toll受體之一，T2DM所導致機體長期處于慢性炎性的過程可能會使得活性受體數量減少。CD14不能單獨激活巨噬細胞吞噬病原體，而要與其他因子結合后才能夠增強TLR4功能。所以，這可能是T2DMTB患者TLR4、CD14水平較T2DM患者降低的原因之一。T2DMTB組TLR4和CD14水平雖較T2DM組低，但較對照組高，說明T2DMTB是感染性疾病，患者機體會伴隨炎癥反應過程TLR4和CD14水平升高。血清中Toll樣受體家族的TLR4和CD14水平變化提示了TLR4、CD14與T2DMTB發病有關，而T2DMTB患者血清中TLR4和CD14水平低于T2DM患者，可能是T2DMTB發病的關鍵。

T2DM患者并發肺結核會導致傳染源增多，受威脅人群增多，結核患病風險增大。同時，T2DMTB治療和控制也是臨床工作中面臨的新挑戰。本研究的創新之處就是對T2DMTB的發病機制進行探究，并根據大量臨床及科研經驗選擇TLR4和CD14對T2DMTB的發病機制進行推斷。但因本研究僅為臨床觀察性研究，所得證據強度較弱，僅對病因有提示作用，無法深入闡述病因機制。

單純用環境因素不僅無法解釋糖尿病和結核病兩種看似發病機制相互矛盾的疾病能同時發生于同一個機體的原因，也無法解釋臨床工作中常見的糖尿病家族成員雖在同一環境中均有結核分枝桿菌接觸史，但并不共同患結核病的現實。這些實際工作中的發現促使我們不得不從遺傳學方面考慮糖尿病并發肺結核的病因。基因多態性可以影響基因轉錄激活，從而改變細胞因子的產生水平。基因多態性的存在并不會直接導致某種疾病的發生，但會使得個體在某種特殊環境或其他危險因素存在時疾病易感性發生改變。因此，筆者下一步將從細胞因子的基因多態性層面進行研究，以進一步探索糖尿病患者結核病易感性的遺傳學病因。

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(本文編輯：李敬文)

Association between serum levels of inflammatory cytokines toll-like receptor 4 and lipopolysaccharide receptor 14 and occurrence of type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis

LIYu-ze*,LIUYu-qin,CHENXiang-li,HOUShao-ying,Hayder,JIANGHui,LIDian-zhong.

*HeilongjiangProvincialTuberculosisControlCenter,Harbin150500,China

s:JIANGHui,Email：jianghui7722@163.com;LIDian-zhong,Email：lidianzhong2010@163.com

Objective To investigate the relationship between serum levels of inflammatory cytokines Toll-Like receptor 4 (TLR4), lipopolysaccharide receptor 14 (LPS receptor) and type 2 diabetes mellitus complicated with tuberculosis (T2DMTB). Methods We recruited 40 cases with T2DMTB and type 2 diabetes mellitus (T2DM) respectively, and 40 cases of healthy people from the Heilongjiang province fourth hospital between September 2014 and June 2015. The demographic characteristics of the subjects were collected. In addition, 3 to 4 ml venous blood was collected in the early morning. The serum levels of TLR4 and CD14 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and compared. Results The serum grades of TLR4 in the control group, T2DM group and T2DMTB group were (10.21±2.29) ng/ml, (19.40±1.80) ng/ml and (15.27±2.52) ng/ml, respectively. The differences among the three groups were significant (F=76.33,P<0.01). The serum grades of CD14 in the control group, T2DM group and T2DMTB group were (9.17±1.62) ng/ml, (16.48±1.54) ng/ml and (10.86±1.65) ng/ml, respectively. The differences among the three groups were significant (F=113.92,P<0.01). The serum grades of TLR4 and CD14 in T2DM and T2DMTB groups were significantly higher than healthy control group, but the serum levels of TLR4 and CD14 in T2DMTB group was significantly by compared with T2DM group (P<0.05). Conclusion The serum levels of TLR4 and CD14 in T2DMTB group were higher than those in control group, but lower than that in T2DM group. The changes of the serum levels of TLR4 and CD14 with T2DMTB suggest that they play an important prompt role on the pathogenesis of T2DMTB.

Tuberculosis； Pulmonary； Diabetes mellitus； Type 2； Chemokines； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.008

黑龍江省衛生廳科研項目(2012-432)

150500 哈爾濱，黑龍江省傳染病防治院(李雨澤、劉玉琴、姜輝、李殿忠)；哈爾濱醫科大學公共衛生學院[陳向麗(碩士研究生)、侯紹英]；哈爾濱工業大學[Hayder(伊拉克籍碩士研究生)]

姜輝，Email：jianghui7722@163.com；李殿忠，Email：lidianzhong2010@163.com

2016-11-13)