類風濕關節炎與IL-1RAP基因多態性關聯的研究

劉曦 胡成棟 李盼 張源潮 楊清銳

類風濕關節炎與IL-1RAP基因多態性關聯的研究

劉曦 胡成棟 李盼 張源潮 楊清銳

目的 探索IL-1RAP基因多態性與類風濕關節炎(RA)的關聯性。方法 選取178例RA患者(RA組)及207例正常對照的全血標本，提取DNA、基因分型，對病例組與對照組IL-1RAP rs766442的等位基因頻率、基因型進行分析。結果 IL-1RAP rs766442 基因型包括GG、GT、TT，RA組與正常對照組間三種基因型頻率差異有統計學意義(P=0.038)、等位基因頻率差異有統計學意義(P=0.018)。結論 攜帶T等位基因的RA患者出現RF-IgG陽性的幾率可能較高，IL-1RAPrs766442的TT基因型可能為RA的易感基因。

類風濕關節炎；IL-1RAP基因

類風濕關節炎(RA)是一種以破壞性關節病變及關節滑膜炎為主要特征的慢性、侵襲性、進行性自身免疫性疾病，可導致非常高的致殘、致畸率，其本質為由未知抗原刺激所引起的免疫反應[1-3]，導致局部關節滑膜組織及血循環中的免疫細胞活化，其產生大量炎性細胞因子是導致類風濕性關節炎病程進展的關鍵因素。滑膜組織和滑膜細胞中浸潤的淋巴細胞、單核/巨噬細胞等通過旁分泌或自分泌的方式產生大量的炎性介質和細胞因子，參與RA的致病過程[4-6]。白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)作為體內最強的炎性介質之一，其能夠介導多種炎性反應，生物學作用非常廣泛。許多研究己經證明IL-1在類風濕關節炎發病的過程中具有非常重要的作用，它不僅參與滑膜炎癥與血管翳的形成，而且在軟骨與骨的破壞和修復中起重要作用，有研究表明IL-1基因多態性在決定RA的預后上起重要作用[7-9]。IL-1需要與受體結合后才能啟動信號轉導，發揮生物學功能，IL-1RAP不能單獨與IL-1相結合，但可使IL-1RⅠ與IL-1的親和能力增加，在IL-1與IL-1R的結合中扮演著重要角色。引起RA的病因非常多，一般認為由環境因素和遺傳因素共同作用所誘發。因個體對類風濕性關節炎易感性程度不同，使得個體在微生物及其抗原等的誘導下產生自身免疫反應，導致關節軟骨、滑膜等組織損傷，所以遺傳因素在疾病的發生、發展中起著非常重要的作用，幾乎決定了人體對于疾病發生的嚴重程度和疾病的易感程度。有相關研究通過對家系的調查發現類風濕關節炎的遺傳因素高達60%[10]，異卵雙生子共同患類風濕關節炎的幾率約為13%，單卵雙生子同患類風濕關節炎的幾率約為27%，均比普通人群高。雖然類風濕關節炎非遺傳性疾病，但是等位基因之間的差異有可能導致個體對疾病的免疫應答能力或易感性高低有別，在病原體及其他誘發因素的作用下患RA的幾率可能會有所不同[11]。本文探討IL-1RAP基因多態性與RA的關聯性，進一步印證RA發病機制與遺傳學的密切關聯。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例組178例RA患者均來自中國北方漢族人群，來自河北省邯鄲市中心醫院，其中男42例，女136例;年齡18～64歲，平均年齡(41.2±2.7)歲。所有患者符合1987年ACR類風濕關節炎的診斷標準，排除DM/PM、SLE、甲狀腺疾病、糖尿病等自身免疫性疾病。檢測患者RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM、抗CCP抗體、RA33、GPI抗體。正常對照組207例均為邯鄲市中心醫院體檢中心健康中國北方漢族人，男54例，女153例；年齡23～65歲，平均年齡(41.2±2.9)歲。無自身免疫病、腫瘤、傳染病等疾病，性別、年齡均與RA組匹配。

1.2 試驗方法

1.2.1 標本收集:收集類風濕關節炎患者空腹靜脈血2 ml置于抗凝采血管中，儲存于-80℃冰箱待檢。

1.2.2 提取DNA及DNA純度測定:將提取的DNA采用比色法測定其純度，OD260/OD280均在1.6～2.0，表明所提取的DNA中含蛋白質及其他雜質較少，純度較高。

1.2.3 SYBR Green I染料法Real-time PCR熔解曲線法基因分型:建立反應體系，按所需反應的樣本例數在EP管中加入相應體積的SYBR GreenⅠ、Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mix、dH2O、MgCl2、DMSO，短暫混勻、離心，再用移液器按反應體系分別加入PCR反應板各孔底部，依次加入三條引物、模板DNA后迅速密閉封口膜，上述操作均在冰上進行。將PCR反應板放入離心機短暫離心，3 000 rPm，離心1 min使混合液集中于底部。應用羅氏LightCycler480分析儀進行基因分型。見表1。

表1 引物

1.3 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件計算基因型、等位基因對疾病的相對危險度(odds ratio,OR)及95%可信區間(95% confidence intervals,CI) (SPSS Inc,Chicago,USA)。Hardy-Weinberg平衡(HWE)檢驗采用χ2分析，分析等位基因及基因型頻率用卡方分析或 Fisher 精確概率分析(樣本數據少于5時)及多重檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因型頻率及等位基因頻率在RA及正常人的分布 查閱NCBI網站，中國北京漢族人群IL-1RAP的SNP位點rs766442包括GG、GT、TT三種基因型，G/T等位基因頻率比例為0.098/0.902，本實驗178例RA患者中，GG基因型為0例，GT基因型為33例，TT基因型為145例，等位基因頻率比例G/T為 0.093/0.907。207例正常對照組人群中，GG基因型為4例，GT基因型為56例，TT基因型為147例，等位基因頻率比例G/T為0.152/0.848。2組間三種基因型頻率(P=0.038)、等位基因頻率(P=0.018)差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 IL-1RAP rs766442基因型和等位基因頻率分布 例(%)

2.2G/T多態性與RF-IgA的關聯 178例RA患者中RF-IgA陽性的為113例，RF-IgA陰性者為65例。其中RF-IgA陽性RA患者GT基因型為21例，TT基因型為92例，等位基因頻率比例G/T為0.092/0.908。65例RF-IgA陰性RA患者GT基因型為12例，TT基因型為53例，等位基因頻率比例G/T為0.093/0.907。2組間三種基因型頻率(P=0.975)、等位基因頻率(P=0.976)差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 IL-1RAP rs766442G/T多態性與RF-IgA的關聯 例(%)

2.3 G/T多態性與RF-IgG的關聯 162例RA患者中RF-IgG陽性的為138例，RF-IgG陰性者為40例。其中RF-IgG陽性RA患者GT基因型為21例，TT基因型為117例，等位基因頻率比例G/T為0.076/0.924。37例RF-IgG陰性RA患者GT基因型為12例，TT基因型為28例，等位基因頻率比例G/T為0.149/0.851。2組間三種基因型頻率差異有統計學意義(P=0.046)，等位基因頻率差異無統計學意義(P=0.0588)。見表4。

表4 IL-1RAP rs766442G/T多態性與RF-IgG的關聯 例(%)

2.4G/T多態性與RF-IgM的關聯 162例RA患者中RF-IgM陽性的為158例，RF-IgM陰性者為20例。其中RF-IgM陽性RA患者GT基因型為30例，TT基因型為128例，等位基因頻率比例G/T為0.094/0.906。20例RF-IgM陰性RA患者GT基因型為3例，TT基因型為17例，等位基因頻率比例G/T為0.083/0.917。2組間三種基因型頻率(P=0.830)、等位基因頻率(P=0.839)差異無統計學意義。見表5。

表5 IL-1RAP rs766442G/T多態性與RF-IgM的關聯 例(%)

3 討論

3.1IL-1RAP在類風濕關節炎發病過程中的作用IL-1在參與調節機體免疫應答過程中，其作為炎性反應中一種重要的炎性細胞因子,需要與受體結合后才能啟動信號傳導，發揮其生物學功能[12-16]。IL-1受體家族包括3型:IL-1RⅠ、IL-1RⅡ和IL-1RAP，均屬于免疫球蛋白超家族。IL-1RAP分子量為66kD，是一種擁有570個氨基酸的糖蛋白，含有20個氨基酸的信號肽，29個氨基酸的跨膜區，340個氨基酸的胞外區和181個氨基酸的胞漿區，基因位置為3q28[17-20]。在IL-1受體家族中，IL-1RⅠ是IL-1的功能性受體，IL-1與之結合后可產生生物學作用,而IL-1RⅡ為IL-1的偽受體,與IL-1 結合后不能轉導信號，從而不能產生物學效應。IL-1RAP不能夠單獨與IL-1相結合，但它在IL-1與IL-1R的結合中扮演著重要角色：一方面，同時表達IL-1RⅠ和IL-1RAP的細胞株與IL-1的親和能力高于單表達IL-1RI的細胞株與IL-1的親和能力，另一方面，有了IL-1RAP參與，IL-1RⅡ和IL-1的親和力增加超過20倍[21-23]。除此以外，IL-1RAP在IL-1信號轉導中發揮重要作用：實際上IL-1RI相關激酶(IRAK)是通過與IL-1RI復合物中的IL-1RAP相互結合后發生磷酸化，磷酸化后的IRAK與TRAF6 結合, 形成一種復合物，導致轉錄因子NF-κB的激活和核易位，然后產生一系列炎性級聯反應。因此，IL-1RAP在TLRs信號轉導通路中及炎性因子IL-1的生物學功能中發揮著關鍵作用，可能直接或間接參與了RA的進展與轉歸過程。

3.2IL-1RAP基因多態性與類風濕關節炎的關聯 隨著對類風濕關節炎相關遺傳學研究的深入，已證實其 與人類白細胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)有相關性，HLA-Ⅱ基因具有高度的多態性，它是參與機體免疫應答和特異性識別的關鍵成分，DR、DP和DQ三類基因均與RA的發病相關。隨著人們對基因研究技術的不斷進展，已有更多學者將研究方向轉向了非MHC基因。SNPs是在基因組水平上由單個核苷酸變異所導致的DNA序列的多態性，其中包括了單個堿基的插入、顛換、轉換或缺失。外顯子區域中的基因突變可影響蛋白質的表達，啟動子區域中的基因突變可直接影響核基因的表達水平，內含子區域中基因的突變則可影響剪接的結果。

IL-1RAPrs766442位點包括GG、GT、TT三種基因型，本實驗中RA患者未檢測出GG基因型，RA組和正常對照組之間等位基因頻率(P=0.018)、基因型頻率(P=0.038)差異均有統計學意義(P<0.05)。RF-IgG陽性的類風濕關節炎患者TT基因型比例(84.8%)高于RF-IgG陰性的類風濕關節炎患者(70.3%)，差異有統計學意義(P<0.05)。因此 ，IL-1RAPrs766442TT基因型可能為類風濕關節炎的易感基因，攜帶T等位基因的類風濕關節炎患者RF-IgG陽性概率可能較高，這有待于擴大樣本量進一步驗證。

對于類風濕關節炎發病機制相關的候選基因的遺傳變異進行研究，可能對患者的疾病進展及預后作出評估和指導臨床治療，還可能發現治療類風濕關節炎的有效靶點，因此對于類風濕關節炎的遺傳學進行研究，使得類風濕關節炎臨床診療有重要的指導意義。

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Correlation between rheumatoid arthritis and IL-1 RAP gene polymorphism

LIUXi*,HUChengdong,LIPan,etal.

*DepartmentofImmunity,CentralHospitalofHandanCiity,Hebei,Handan056001,China

Objective To investigate the correlation between rheumatoid arthritis (RA) and IL-1 RAP gene polymorphism.Methods One hundred and seventy-eight patients with RA (case group) and 207 healthy subjects (control group) were enrolled in the study.The whole blood specimens of all the subjects were taken,then DNA was extracted for genotyping.The allele frequency of IL-1RAP rs766442 and genotypes were detected and statistically analyzed.Results There were significant differences in the IL-1 RAP rs766442 genotype frequency including GG, GT, TT between two groups (P<0.05),moreover,therewasasignificantdifferenceinallelefrequencybetweentwogroups(P<0.05).Conclusion The RA patients with T allelic gene have higher probability to present positive RF-IgG, and the TT genotype of IL-1RAP rs766442 may be the predisposing gene of RA.

rheumatoid arthritis; IL-1RAP gene

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.05.014 ·論著·

056001 河北省邯鄲市中心醫院免疫科(劉曦)，骨二科(胡成棟、李盼)；山東省立醫院風濕免疫科(張源潮、楊清銳)

R

A

1002-7386(2017)05-0694-04

2016-09-11)