GSK-3β抑制劑在七氟醚誘發老年大鼠海馬神經元凋亡中的作用

蔣仁江，王雨薇，張加強

1. 河南省焦作煤業(集團)有限公司中央醫院(焦作 454000)；2. 河南省焦作市人民醫院(焦作 454000)；3. 河南省人民醫院(鄭州 450003)

GSK-3β抑制劑在七氟醚誘發老年大鼠海馬神經元凋亡中的作用

*蔣仁江1，王雨薇2，張加強3

1. 河南省焦作煤業(集團)有限公司中央醫院(焦作 454000)；2. 河南省焦作市人民醫院(焦作 454000)；3. 河南省人民醫院(鄭州 450003)

目的 探討GSK-3β抑制劑在七氟醚誘發老年大鼠海馬神經元凋亡中的作用。方法 54只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組(n=18)、七氟醚組(n=18)和GSK-3β抑制劑組(n=18)，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠分別經尾靜脈注射生理鹽水15 mL和GSK-3β抑制劑15 mg/kg，連續吸入七氟醚4 h，假手術組大鼠經尾靜脈注射生理鹽水15 mL，連續吸入氧氣和氮氣(1∶1)混合氣體4 h。每組各取6只大鼠，分別于麻醉前30 min(T0)、麻醉后1、2、3、4 d，利用Morris水迷宮實驗評估大鼠認知功能，分別于麻醉前30 min、麻醉后1 d和5 d，檢測海馬組織中神經元凋亡情況，利用Western blot法檢測海馬組織中caspase-3、GSK-3β和p-GSK-3β表達。結果 與假手術組相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d和2 d時逃避潛伏期均延長，穿越平臺次數減少，原平臺所在象限停留時間縮短，與七氟醚組相比，GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d和2 d時逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增多，原平臺所在象限停留時間延長；與假手術組相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d時神經元凋亡率、caspase-3蛋白、GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表達量均升高，與七氟醚組相比，GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d時神經元凋亡率、caspase-3蛋白、GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表達量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 GSK-3β參與了七氟醚誘發老年大鼠海馬神經元凋亡，抑制GSK-3β蛋白活化可減少神經元凋亡發生。

老年大鼠；七氟醚；GSK-3β抑制劑；神經元凋亡

術后認知功能障礙(postoperation cognitive dysfunction，POCD)作為老年患者術后常見嚴重并發癥[1]，嚴重影響患者術后恢復。海馬作為學習、記憶功能的重要調控區域，其神經元在氧化應激、炎癥反應等因素刺激下發生凋亡是導致認知功能障礙的重要機制[2]。七氟醚是臨床常用的吸入性全麻藥，可導致患者發生POCD[3]，研究[4]表明，七氟醚所致POCD與海馬神經元凋亡密切相關。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)作為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，可通過誘導tau蛋白過度磷酸化，從而導致海馬神經元損傷和凋亡[5]，氯化鋰作為GSK-3β的抑制劑，可減少GSK-3β所致神經元凋亡[6]。本研究擬對GSK-3β抑制劑氯化鋰對七氟醚誘發老年大鼠海馬神經元凋亡的影響進行分析，并探討可能的機制，以期為臨床實踐提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠54只，18～20月齡，體質量450～600 g，由河南省實驗動物中心提供，飼養于安靜環境中，自由進食、進水。利用隨機數字表進行隨機化分組：假手術組(n=18)、七氟醚組(n=18)和GSK-3β抑制劑組(n=18)。

1.1.2 主要試劑和儀器 七氟醚購自上海恒瑞醫藥有限公司(批號：國藥準字H20070172)，GSK-3β抑制劑購自美國Sigma公司， Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司，鼠抗GSK-3β、p-GSK-3β單克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司，抗caspase-3單克隆抗體購自艾美捷科技有限公司，Morris水迷宮行為檢測系統購自上海欣軟信息科技有限公司，麻醉氣體監測儀購自美國Datex-Ohmeda公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 假手術組和七氟醚組大鼠分別經尾靜脈注射生理鹽水15 mL，GSK-3β抑制劑組大鼠則經尾靜脈注射GSK-3β抑制劑15 mg/kg，放置在鋪有少量鈉石灰的有機玻璃麻醉箱中，箱體左右兩側各留有一小圓孔。七氟醚組和GSK-3β抑制劑組一端連接七氟醚揮發罐，連續輸入七氟醚4 h， 另一端作為出氣孔，連接麻醉氣體監測儀，對七氟醚、氧氣及二氧化碳濃度進行監測，通氣流量2 L/min； 假手術組則連續輸入氧氣和氮氣(1∶1)混合氣體4 h，通氣流量2 L/min。

1.2.2 Morris水迷宮實驗 每組各取6只大鼠，分別于麻醉前30 min(T0)、麻醉后1、2、3、4 d，利用Morris水迷宮實驗評估各組大鼠認知功能。定位航行實驗：將大鼠從不同象限頭朝池壁放入水池中，記錄大鼠每次找到平臺的時間作為逃避潛伏期，取均值，連續進行4 d，若60 s內大鼠未找到平臺，則將大鼠引導到平臺上停留15 s，逃避潛伏期記為60 s。 空間探索實驗：第5天時將平臺撤去，從任一象限將大鼠朝池壁放入，記錄其60 s內穿越平臺次數，以及在平臺所在象限停留時間。

1.2.3 利用流式細胞技術檢測海馬組織中神經元凋亡情況 于麻醉前30 min各組取6只大鼠，麻醉后1 d各組取6只大鼠，以及麻醉后5 d Morris水迷宮實驗后各組取6只大鼠，利用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉處死后，留取海馬組織，保存于液氮中以備檢。取海馬組織1 g，研磨后制備細胞懸液，于1 500 r/min離心5 min，留取沉淀，將緩沖液加入，制備單細胞懸液(濃度1×105～5×105個/mL)，分別將Annexin V和PI加入后，避光孵育5 min，利用流式細胞儀進行檢測，以熒光強度反映神經元凋亡率。

1.2.4 Western blot法檢測海馬組織中caspase-3、GSK-3β、p-GSK-3β表達 取海馬組織1 g研磨后，加入蛋白裂解液裂解，4 ℃條件下勻漿離心，取上清，用總蛋白檢測試劑盒對總蛋白含量進行檢測。行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉膜后，用含5%脫脂奶粉的PBST于室溫條件下封閉30 min，用PBST液洗滌3次，分別將一抗caspase-3單克隆抗體、鼠抗GSK-3β、p-GSK-3β單克隆抗體(稀釋濃度分別為1∶1 000、 1∶800和1∶500)，4 ℃過夜孵育，用PBST沖洗3次，將HRP標記的山羊抗大鼠二抗(1∶1 500稀釋)加入，室溫下搖動60 min，用PBST洗膜，用ECL化學發光試劑盒進行發光反應，曝光顯像后，用Image J軟件對圖像進行分析，以β-actin為內參，用相對灰度比值表示目的蛋白表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗結果

與麻醉前30 min相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d和2 d時逃避潛伏期均延長，差異均有統計學意義(P<0.05)；與假手術組相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d和2 d時逃避潛伏期均延長，穿越平臺次數減少，原平臺所在象限停留時間縮短，差異均有統計學意義(P<0.05)；與七氟醚組相比，GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d和2 d時逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增多，原平臺所在象限停留時間延長，差異均有統計學意義(P<0.05)(表1和表2)。

表1 3組大鼠穿越平臺次數和原平臺所在象限停留時間比較(n=6，±s)

注：與假手術組相比，aP<0.05；與七氟醚組相比，bP<0.05

2.2 3組大鼠不同時點神經元凋亡率和海馬組織中相關蛋白表達比較

與麻醉前30 min相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d神經元凋亡率、caspase-3蛋白、GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表達量均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與假手術組相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d神經元凋亡率、caspase-3蛋白、GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表達量均升高，但與七氟醚組相比，GSK-3β抑制劑組升高的幅度低，差異均有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表2 3組大鼠逃避潛伏期比較

注：與麻醉前30 min相比，aP<0.05；與假手術組相比，bP<0.05；與七氟醚組相比，cP<0.05

表3 3組大鼠不同時點神經元凋亡率和海馬組織中相關蛋白表達比較±s)

注：與麻醉前30 min相比，aP<0.05；同一時點與假手術組相比，bP<0.05；同一時點與七氟醚組相比，cP<0.05

3 討論

POCD是老年全麻手術患者術后常見中樞系統并發癥，患者主要表現為記憶力、精神集中能力和定向力等多方面的可逆性障礙，亦有少數患者出現不可逆性損傷[7]。目前，POCD具體發生機制尚未明確，有研究[8]表明，全麻藥物、手術應激等均可誘發腦組織炎癥反應，釋放的炎癥因子可影響神經元功能并誘導其凋亡，與POCD發生密切相關。GSK-3作為具有多種功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種生理功能，GSK-3β是其重要亞型，在細胞凋亡中發揮重要作用[9]。氯化鋰作為GSK-3β抑制劑，被應用于神經退行性疾病的治療中，可通過抑制GSK-3β活性而減少神經元凋亡，促進神經再生[10]。本研究為進一步探討GSK-3β抑制劑對POCD發生的影響，結合文獻[11]，采取吸入七氟醚4 h的方式制備POCD模型，并結合文獻[12]和預實驗，采取經尾靜脈注射GSK-3β抑制劑15 mg/kg的方式進行干預，Morris水迷宮實驗結果顯示，與假手術組相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d和2 d時逃避潛伏期均延長，穿越平臺次數減少，原平臺所在象限停留時間縮短，提示老年大鼠吸入七氟醚4 h后發生了POCD。

本研究顯示，與七氟醚組相比，GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d和2 d時逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增多，原平臺所在象限停留時間延長，說明使用GSK-3β抑制劑干預后，可顯著改善大鼠認知功能。本研究顯示，與假手術組相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d時神經元凋亡率、caspase-3蛋白表達量均升高，但相比七氟醚組，GSK-3β抑制劑組升高的幅度低，說明七氟醚所致POCD與凋亡執行蛋白caspase-3被活化，以及神經元細胞大量凋亡有關，而GSK-3β抑制劑干預則可抑制caspase-3蛋白活化，減少神經元細胞凋亡發生。本研究顯示，與假手術組相比，七氟醚組和GSK-3β抑制劑組大鼠麻醉后1 d時GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白表達量均升高，但相比七氟醚組，GSK-3β抑制劑組升高的幅度低，說明七氟醚吸入后發生POCD可能與GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白活化有關，研究[13]表明，活化的GSK-3β可通過激活NF-κB而促進促炎因子合成及釋放，炎性反應可進一步促進tau蛋白磷酸化而誘導神經元細胞凋亡。而加入GSK-3β抑制劑進行干預后，則可抑制GSK-3β蛋白和p-GSK-3β蛋白活性，減少炎癥反應，降低tau蛋白磷酸化程度，從而有效保護了神經元細胞。

綜上所述，GSK-3β參與了七氟醚誘發老年大鼠海馬神經元凋亡，其抑制劑可通過抑制GSK-3β蛋白活化而減少神經元凋亡的發生。

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The Role of GSK-3β Inhibitor in the Sevoflurane Anesthesia-induced Apoptosis of Aged Rats′ Hippocampal Neurons

JiangRenjiang1,WangYuwei2,ZhangJiaqiang3.

1.TheCentralHospitalofJiaozuoCoalGroupCo.,LTD,Jiaozuo454000,China; 2.ThePeople′sHospitalofJiaozuoCity,Jiaozuo454000,China; 3.HenanProvincialPeople′sHospital,Zhengzhou450003,China

Objective To investigate the role of GSK-3β inhibitor in the sevoflurane anesthesia-induced apoptosis of aged rats′ hippocampal neurons. Methods 54 healthy male SD rats were divided randomly into the sham operation group (n=18), sevoflurane group (n=18) and GSK-3β inhibitor group (n=18). The rats in the sevoflurane and GSK-3β inhibitor group were injected with 15mL saline and GSK-3β inhibitor 15mg/kg via the tail vein respectively and inhaled sevoflurane continuously for 4 hours. The rats in the sham operation group were injected with 15mL saline via the tail vein and inhaled the mixed gas of oxygen and nitrogen (1∶1) continuously for 4 hours. Six rats were selected from each group and their cognitive function were assessed via Morris water maze test 30 minutes before anesthesia, and 1 day, 2, 3 and 4 days after anesthesia respectively. The apoptosis in hippocampal neurons were detected and the expressions of caspase-3, GSK-3β, p-GSK-3β proteins in hippocampus were tested by Western blot analysis 30 minutes before anesthesia, and 1 day and 5 days after anesthesia respectively. Results Compared with the sham operation group, the escape latencies 1 day and 2 days after anesthesia in the sevoflurane group and GSK-3β inhibitor group were prolonged, the times of crossing platforms were reduced, and the residence time in the quadrant of the former platform were shortened. Compared with the sevoflurane group, the escape latencies after 1-day and 2-day anesthesia in the GSK-3β inhibitor group were shortened, the numbers of crossing platforms were increased, and the residence time in the quadrant of the former platform were prolonged. Compared with the sham operation group, the apoptosis rates and the expression levels of caspase-3 protein, GSK-3β protein and p-GSK-3β protein after 1-day and 2 day anesthesia in the sevoflurane group and GSK-3β inhibitor group were increased. Compared with the sevoflurane group, the apoptosis rates and the expression levels of caspase-3 protein, GSK-3β protein and p-GSK-3β protein after 1-day anesthesia in the GSK-3β inhibitor group were decreased, the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion GSK-3β is involved in the sevoflurane anesthesia-induced apoptosis of aged rats′ hippocampal neurons, therefore, the inhibition of GSK-3β protein activator could reduce the neuronal apoptosis.

Aged rats; Sevoflurane; GSK-3β inhibitor; Neuronal apoptosis

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170111.1045.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.003

河南省2015年科技發展計劃(No：152300410163)

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