博來霉素氣管多次給藥誘導小鼠肺纖維化模型

陳孟毅++林帥++杜朋++李程程++孟愛民

[摘要] 目的 建立小鼠博來霉素氣管多次給藥肺纖維化模型。 方法 SPF級雄性C57BL/6J小鼠45只，按體重隨機分為未處理組（5只）和處理組（40只），未處理組小鼠不經處理，處理組小鼠博來霉素氣管給藥（0.4 mg/mL），2周給藥1次，共8次。處理組小鼠在初次給藥后2周、1個月、2個月、4個月時分別取出肺組織稱重計算肺系數、固定做HE染色和Masson染色，制備冰凍切片進行細胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色。 結果 與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在給藥2周時肺系數顯著升高（P < 0.05）；同時，肺組織病理觀察結果顯示，給藥2周時，小鼠肺泡腔內滲出和血管周圍炎細胞浸潤較為嚴重，病理評分與未處理組小鼠比較顯著升高（P < 0.05）。此外，處理組小鼠在給藥2周、2個月與4個月時肺泡間隔增寬相對穩定，與未處理組小鼠比較，病理評分顯著升高（P < 0.05），但胞漿滲出逐漸減少、炎細胞浸潤減輕，評分接近未處理組小鼠水平；膠原染色結果顯示處理組小鼠在給藥2周時出現藍綠色的膠原纖維，并在1、2、4個月時膠原纖維持續存在；SA-β-Gal染色結果表明，與未處理組小鼠比較，博來霉素氣管給藥4個月時小鼠的肺組織中衰老細胞明顯增多。 結論 博來霉素氣管多次給藥可以建立小鼠肺纖維化模型，且模型小鼠具有肺纖維化進展不可逆、炎性反應明顯減少兩個重要特點，并提示肺纖維化與衰老細胞有一定關系。

[關鍵詞] 博來霉素；纖維化；肺；模型

[中圖分類號] R563.02；R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（b）-0008-04

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明、以彌漫性肺泡炎和肺泡結構紊亂最終導致肺間質纖維化為特征的慢性疾病[1-2]。臨床上除肺移植外無有效的治療手段[3-4]，且預后極差，動物肺纖維化模型在肺纖維化機制及其防治研究中非常重要。二氧化硅[5]、石棉、博來霉素[6]（BLM）等都能誘導肺纖維化，常用BLM誘導肺纖維化模型[7]，BLM氣管給藥是最常用的方式[8]，氣管給藥又分為氣管插管和氣管滴注。有文獻報道BLM單次給藥模型在給藥6周后，小鼠肺損傷部位有明顯修復[9]，與人類肺纖維化疾病的發展過程不同；病理學表現也不相同，人肺纖維化疾病的肺損傷部位細胞外基質的沉積增多，中性粒細胞炎性反應不突出[10]，而單次給藥肺纖維化模型中常有明顯的嗜中性粒細胞的炎性反應[11]，并有文獻顯示經單次給藥肺纖維化模型篩選出的藥物治療方案，在臨床上多數是無效的[12]。基于以上因素，筆者在參閱相關文獻后，擬采用BLM氣管滴注多次給藥方式造成小鼠肺持續性損傷，希望制備更符合人體IPF發病情況的BLM肺纖維化模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠45只（SPF級），體重20～22 g，10～12周，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[動物合格證：SCXK（京）2015-0035]，動物飼養在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所動物房屏障環境內，溫度20～26℃，相對濕度50%～60%。

1.2 試劑

注射用鹽酸BLM：日本化藥株式會社；鹽酸氯胺酮注射液：沈陽市獸藥廠；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒：碧云天；核固紅染色液（0.5%）：北京雷根生物技術有限公司。

1.3 模型建立

14周齡C57BL/6J雄性小鼠按體重隨機分為未處理組（5只）和處理組（40只），處理組氣管滴注BLM溶液（0.4 mg/mL，每只100 μL），未處理組小鼠不經處理，處理組小鼠用注射用鹽酸氯胺酮150 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露聲門，用接套管的1 mL注射器氣管給藥。2周給藥1次，共8次，初次給藥后2周（0.5個月）、1個月、2個月、4個月時取肺組織。

1.4 HE染色

肺組織10%中性甲醛中固定24 h，常規脫水、石蠟包埋后，切片5 μm，進行蘇木精-伊紅染色，普通光學顯微鏡（BX50，Olympus，Japan）觀察肺組織病變，病理學鏡檢人員單盲評分。

1.5 Masson染色

石蠟切片脫蠟，水洗，Masson染色復合液染色5 min，水洗，0.2%醋酸浸洗，1%磷鎢酸浸洗，亮綠染色液染色15 min，水洗，0.2%醋酸浸洗，水洗片刻脫水、透明、固封。

1.6 肺系數

肺系數=肺組織重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.7 冰凍切片

小鼠在BLM初次給藥0.5、1、2、4個月取右肺中葉，速凍后將肺組織浸沒在適量包埋劑中，冰凍切片機制作8 μm的切片。

1.8 細胞衰老β-半乳糖苷酶染色方法

冰凍切片固定液固定15 min，PBS洗3次，每次3 min，配染色液，滴加到切片上，37℃培養箱（無CO2）過夜，PBS洗后核固紅（0.5%）復染15 min。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 博來霉素多次給藥對小鼠體重的影響

處理組小鼠第1次BLM給藥為0周，小鼠每周稱重1次。未處理組小鼠整體上體重呈逐漸上升趨勢。與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在BLM第1次給藥（0周）后體重下降，初次給藥1周時體重處于最低點，隨后體重逐漸增加，在第5周時接近未處理組小鼠體重，之后與未處理組小鼠體重增長趨勢一致，在12周時體重超過未處理組小鼠（圖1）。

2.2 博來霉素多次給藥過程中肺系數的變化

處理組小鼠在0.5、1、2、4個月時的肺系數有高于未處理組小鼠的趨勢，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠0.5個月時肺系數顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；且處理組小鼠在0.5個月時具有高于1、2、4個月時肺系數的趨勢（圖2）。

2.3 博來霉素多次給藥肺組織病理學改變

根據HE染色結果，對肺組織病理學評分：由0～12分組成，3個分類評價指標[13]：肺泡間隔增寬、肺泡腔內纖維化滲出的嚴重度、血管周圍炎細胞浸潤的程度，每種分類分為：0分正常；1分輕度；2分中度；3分重度；4分極重度。合并后記分。

圖3顯示，BLM給藥過程中，小鼠在給藥后0.5、1、2、4個月時肺組織肺泡腔胞漿滲出逐漸減少，炎細胞浸潤依次減弱，但肺泡間隔增寬沒有明顯變化。

A.未處理組；B.0.5個月；C.1個月；D.2個月；E.4個月

圖3 小鼠肺組織HE染色（100×）

從總分來看，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在BLM初次給藥后0.5、1、4個月的評分顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。從單項評分來看，①肺泡間隔增寬：與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在0.5、2、4個月評分顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）；②肺泡腔內滲出：0.5個月時處理組小鼠分數高于其他三個時間點，但差異無統計學意義（P > 0.05），與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在0.5、4個月時評分顯著升高（P < 0.01）；③血管周圍炎細胞浸潤：處理組小鼠0.5個月時與未處理組小鼠比較差異有高度統計學意義（P < 0.01），4個月時處理組小鼠與未處理組小鼠炎細胞浸潤水平接近。見表1。

2.4 博來霉素多次給藥肺組織膠原沉積的變化

與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在初次給藥后0.5個月時出現藍綠色的膠原纖維，在繼續給藥1、2、4個月時膠原纖維持續存在（圖4，封四）。

2.5 博來霉素多次給藥對肺組織衰老細胞的影響

小鼠初次給藥4個月時肺組織冰凍切片進行SAβ-Gal染色，衰老細胞胞漿為藍色。在BLM初次給藥4個月后，處理組小鼠冰凍切片中藍色細胞明顯比未處理組小鼠多，說明處理組小鼠在4個月時肺組織中存在較多衰老細胞（圖5，封四）。

3 討論

BLM單次給藥肺纖維化模型易于操作，在闡明肺纖維化與細胞因子、生長因子[6]信號通路上具有重要作用，如TGF-β在肺纖維化過程中的作用[14]。但該模型并沒有復制出人IPF進展慢、不可逆這兩個重要特點[15]，且炎性反應較為明顯[11]，利用此模型篩選出的200多種治療手段，在臨床轉化后沒有取得預期結果[8]，該模型需要進一步優化。

BLM多次給藥能造成小鼠肺持續性損傷，本研究觀察了BLM多次給藥造模過程中小鼠的動態變化，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠體重相對穩定，肺局部反應持續存在。實驗結果證明，多次給藥肺纖維化模型具有肺纖維化不可逆、炎性反應明顯減弱等優勢，多次給藥模型更接近臨床人類肺纖維化疾病的發展進程。因此，我們希望能利用多次給藥模型進行抗纖維化藥物篩選及藥效學評價，為臨床有效治療肺纖維化提供更多的參考。

目前肺纖維化發病機制尚不明確[16]，之前認為是由慢性炎癥引起肺纖維化[17]，但抑制炎性反應阻止肺纖維化的發展未取得預期效果。近年來研究發現肺泡上皮細胞損傷在肺纖維化發生過程中起重要作用[18]，相比單次給藥，多次給藥模型小鼠炎性反應減少且有明顯的肺泡上皮細胞增生[11，19]，這是多次給藥模型又一優勢，在肺纖維化機制研究中具有重要意義，并能用于上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、肺重塑和修復的評估[11]。

關于BLM肺纖維化模型的機制，之前觀點是BLM誘導DNA斷裂產生自由基誘導氧化應激反應[12]，引起細胞凋亡或壞死，產生炎性反應和纖維化。Aoshiba等[20]認為BLM誘導肺泡Ⅰ型細胞死亡，具有干細胞特性的肺泡Ⅱ型細胞增殖分化進行修復，但BLM造成Ⅱ型細胞損傷，修復過程受阻，纖維母細胞被激活遷移到上皮細胞間缺陷處，從而導致肺纖維化。肺泡Ⅱ型細胞的損傷及過度增殖導致細胞衰老，可能是肺纖維化發生的一種新機制。SAβ-Gal染色結果也證明BLM處理組4個月的小鼠肺組織中出現細胞衰老的現象。通過清除衰老細胞是否可以治療肺纖維化疾病，這將是我們下一步研究的重點，也許是肺纖維化疾病的一個新的治療方向。

[參考文獻]

[1] Demedts M，Costabel U. ATS/ERS international multidisciplinary consensus classification of the idiopathic interstitial pneumonias [J]. EurRespir J，2002，19（5）：794-796.

[2] Huang X，Wang W，Yuan H，et al. Sunitinib，a Small-Molecule Kinase Inhibitor，Attenuates Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Mice [J]. Tohoku J Exp Med，2016， 239（4）：251-261.

[3] Moll S，Chaykovska L，Meier M，et al. Targeting the epithelial cells in fibrosis：a new concept for an old disease [J]. Drug Discov Today，2013，18（11/12）：582-591.

[4] Costabel U. Idiopathic pulmonary fibrosis in 2011：key updates on guidelines and therapeutics Concluding remarks [J]. Respiratory Research，2013，14 Suppl 1：S8.

[5] Latoche JD，Ufelle AC，Fazzi F，et al. Secreted Phosphoprotein 1 and Sex-Specific Differences in Silica-Induced Pulmonary Fibrosis in Mice [J]. Environ Health Perspect，2016，124（8）：1199-1207.

[6] Yilmaz O，Oztay F，Kayalar O. Dasatinib attenuated bleo-mycin-induced pulmonary fibrosis in mice [J]. Growth Factors，2015，33（5/6）：366-375.

[7] Latta VD，Cecchettini A，Ry SD，et al. Bleomycin in the setting of lung fibrosis induction：From biological mechanisms to counteractions [J]. Pharmacol Res，2015，97：122-130.

[8] Degryse AL，Lawson WE. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Am J Med Sci，2011，341（6）：444-449.

[9] Chung MP，Monick MM，Hamzeh NY，et al. Role of repeated lung injury and genetic background in bleomycin-induced fibrosis [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2003，29（3 Pt 1）：375-380.

[10] Moore BB，Hogaboam CM. Murine models of pulmonary fibrosis [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294（2）：L152-160.

[11] Degryse AL，Tanjore H，Xu XC，et al. Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2010，299（4）：L442-452.

[12] Moeller A，Ask K，Warburton D，et al. The bleomycin animal model：a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis？ [J]. Int J Biochem Cell Biol，2008，40（3）：362-382.

[13] Gelinas R，Chesler EJ，Vasconcelos D，et al. A genetic approach to the prediction of drug side effects：bleomycin induces concordant phenotypes in mice of the collaborative cross [J]. Pharmgenomics Pers Med，2011，4：35-45.

[14] Goodwin A，Jenkins G. Role of integrin-mediated TGFbeta activation in the pathogenesis of pulmonary fibrosis [J]. Biochem Soc Trans，2009，37（4）：849-854.

[15] Chua F，Gauldie J，Laurent GJ. Pulmonary fibrosis：searching for model answers [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2005，33（1）：9-13.

[16] Andrade-Sousa AS，Rogerio Pereira P，MacKenzie B，et al. Aerobic Exercise Attenuated Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Th2-Dominant Mice [J]. PLoS One，2016，11（9）：e0163420.

[17] Kropski JA，Lawson WE，Young LR，et al. Genetic studies provide clues on the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Dis Model Mech，2013，6（1）：9-17.

[18] Loomis-King H，Flaherty KR，Moore BB. Pathogenesis，current treatments and future directions for idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Curr Opin Pharmacol，2013，13（3）：377-385.

[19] Lee SH，Lee EJ，Lee SY，et al. The effect of adipose stem cell therapy on pulmonary fibrosis induced by repetitive intratracheal bleomycin in mice [J]. Exp Lung Res，2014， 40（3）：117-125.

[20] Aoshiba K，Tsuji T，Nagai A. Bleomycin induces cellular senescence in alveolar epithelial cells [J]. Eur Respir J，2003，22（3）：436-443.

（收稿日期：2016-10-13 本文編輯：張瑜杰）