遺傳標記在羅非魚良種選育研究中的應用與展望

頡曉勇，鐘金香，趙金良

（1.廣東省漁業生態環境重點實驗室，中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東 廣州510300；2. 廣東省水產技術推廣總站，廣東 廣州，510220；3.上海海洋大學，上海，201306）

遺傳標記在羅非魚良種選育研究中的應用與展望

頡曉勇1，鐘金香2，趙金良3

（1.廣東省漁業生態環境重點實驗室，中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東 廣州510300；2. 廣東省水產技術推廣總站，廣東 廣州，510220；3.上海海洋大學，上海，201306）

綜述了在近些年中傳統遺傳標記羅非魚良種選育相關研究中的應用情況，探討了多種分子標記聯合分析的必要性，展示了羅非魚選育群體基于SSR/AFLP分別計算的Nei（1978）相似性系數比率穩定分布于0.942 07～0.963 70之間，而群體間SSR/AFLP遺傳距離比率全都遠大于1，具有良好的區分度。綜合多種因素，推薦SSR作為羅非魚良種選育群體遺傳多樣性水平的常規監測手段。并指出基于DNA序列測定與生物信息學技術開發的新型分子標記類型應當作為未來羅非魚良種選育研究的重點方向。

羅非魚；遺傳標記；良種選育；綜述

羅非魚優良品種在育種過程中，群體遺傳性狀不可避免地受到保種規模、環境因素等生產條件變遷的影響。對于育種群體數量有限的羅非魚選育過程中群體，在傳代過程中極有可能出現管理不當、近交衰退、瓶頸效應等導致選育良種出現種質退化的風險。因此，進行不同遺傳多樣性方法對比，將為選擇適宜的遺傳多樣性評估方法，展開對于優良品種傳代過程中群體的常規遺傳多樣性水平監測建立必要的技術基礎。

羅非魚優良品種育種群體的遺傳多樣性是其遺傳信息的總和。遺傳多樣性分析通常采用不同類型遺傳標記工具，分析對象包括一個群體內不同個體或者種內不同群體，具體則以群體內及群體間的遺傳變異總和來進行評價。當前研究報道中應用較為廣泛的遺傳標記主要包括四種類型，分別為形態學標記（morphological marker）、細胞學標記（cytologicalmarker）、生化標記（biochemical marker）、和分子標記（molecular marker）。形態標記主要是針對羅非魚的外部形態特征，通常以肉眼觀測即可簡單區分，或者通過形態測量的方法進行。細胞標記主要是染色體的核型和帶型，檢測對象主要是分裂時期的染色體。生化標記是在蛋白質多態的基礎上發展起來的，主要包括同工酶和貯藏蛋白。這三類標記都是生物內在遺傳基因表達的結果，是對基因差異的間接反映，而且表達過程中易受到環境條件的影響，可以統稱為基因表達結果類遺傳標記。

1 基因表達結果類標記

1.1 形態標記

形態標記主要是針對肉眼可見的或儀器測量動物的外部形態，以其遺傳待征為標記，具有簡單、方便、易操作性的優勢。這種方法在傳統的遺傳育種過程中仍然得到大量應用，育種工作者可以直接根據羅非魚的體長、體高、體寬等，以及相對的生長速度差異等性狀來進行優良品種的選擇。郭金濤等[1]通過6個可數性狀、10個可量性狀及24個框架性狀，比較分析了尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus♀）×薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron♂）雜交后代F1、F2形態性狀的遺傳與變異特征，建立了不同群體的可數性狀、可量與框架性狀的判別公式，其雜交F1形態遺傳了雙親的形態特征，且有一定的偏母遺傳。唐瞻楊等[2]以尼羅羅非魚不同月齡個體為研究對象進行了形態性狀主成分及其判別分析，基于不同階段生長指標主成份差異，得到了尼羅羅非魚形態指標的增長規律，并判定了其最佳生長季節體格與月齡的關系。

1.2 細胞標記

細胞標記是對經過固定、壓片、染色等程處理過的染色體，主要包括染色體相對長度、著絲點位置、臂比值、臂指數等指標，分析染色體核型和帶型及缺失、重復、易位、倒位等。李思發等[3]對尼羅羅非魚和薩羅羅非魚正反雜交子代的頭腎細胞的核型進行了比較，發現4種遺傳型羅非魚具有相同的染色體二倍數（2n=44）和總臂數（NF=50），但各具不同的染色體類型，正反雜交子代表現為介于雙親之間的混合類型。朱華平等[4]采用體腔注射PHA-空氣干燥法對橙色莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）和荷那龍羅非魚（O.hornorum）染色體數量、形態和核型進行了分析，結果顯示兩種羅非魚染色體核型公式均為2n=44，6sm+24st+14t，NF=50，用常規染色體染色的方法難以區分，表明這兩種羅非魚的常規核型差異不顯著，在分類地位上非常接近。

1.3 生化標記

生化標記主要指血型、血清蛋白及同工酶等，是鑒定外源DNA和研究物種起源及進化方面的有效工具。同工酶是生物體內催化同一化學反應但具有不同分子結構的蛋白質分子，同工酶標記表現為共顯性，需要的實驗材料少，操作簡便，檢測結果較為穩定，目前仍是生物群體遺傳特性研究中應用較多的一種分析方法。同工酶作為基因表達的產物，是一種可靠的遺傳標記。李思發等[3]采用同工酶電泳方法檢測了尼羅羅非魚和薩羅羅非魚正反雜交子代的腎、肝、眼、肌肉、心中乳酸脫氫酶等4種同工酶的表型差異，推測核型和同工酶方面的差異可能是導致這兩種不同屬羅非魚生殖隔離的遺傳原因。楊淞等[5]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳法分析了酯酶（EST）、超氧化物歧化酶（SOD） 和乳酸脫氫酶（LDH） 3種同工酶在荷那龍羅非魚（Oreochromis hornorum）和莫桑比克羅非魚（O.mossambicus）肝臟、心臟、肌肉、腦和腎臟5種器官組織中的表達情況，表明兩種羅非魚的這3種同工酶均具有明顯的組織特異性，且EST-7和EST-8僅分別存在于莫桑比克羅非魚的心臟和腦器官中，可作為鑒別兩種羅非魚的標記。

2 DNA分子標記

遺傳多樣性的表現方式多種多樣，通常以遺傳變異程度的高低進行衡量。遺傳多樣性的本質則是遺傳物質DNA分子的多態性。與基于基因表達結果類遺傳標記相比，DNA 分子標記是對個體間核苷酸序列變異的直接分析，是遺傳變異的直接反映，相較而言具有獨特的遺傳穩定性、可靠性和準確性。

目前羅非魚良種選育研究報道中應用的DNA標記技術已有多種，主要包括針對核基因對象的限制性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態性DNA（RAPD）、擴增片段長度多態性（AFLP）、簡單重復序列（SSR）、源于表達序列標簽 （EST）庫的SSR（EST-SSR）和單核苷酸多態性（SNP） 等，以及針對細胞器基因（包括片段）序列多態性等，這些DNA 標記技術各具特色，各有所用。有關這些技術的特征詳見另文介紹。

2.1 不同種類DNA標記對比分析

采用不同種類標記對進行對比研究的報道在植物學領域相對較多，而動物學尤其是在魚類方面比較少。如Russell et al[6]采用RFLPs，RAPDs，SSRs，AFLPs四種方法對大麥進行遺傳差異分析，發現得到的基因多樣性指數分別為0.322，0.521，0.566，0.937；遺傳相似度估計值分別為0.843，0.879，0.829，0.924。Patzak 等[7]對啤酒花（Humulus lupulus L.）遺傳變異采用四種分子標記系統進行了分析；Uptmoor等[8]對高梁（Sorghum bicolor）采用RAPD、AFLP、SSR三種多態性標記進行了研究；Belaj等[9]對橄欖采用RAPD、AFLP、SSR分析，認為分辨能力（discriminating capacity）AFLP為0.99，SSR為0.90，RAPD為0.85；區分功效（discriminating power）為AFLP＞SSR＞RAPD。

2.2 基于不同標記方法的聯合分析

2.2.1 不同標記聯合分析群體遺傳多樣性 在之前的絕大多數羅非魚遺傳分析報道中，通常都是僅采用1種或2種遺傳多樣性分析手段對同一套育種動物群體進行分析評價，原因主要可能是由于受到實驗方法和技術手段等的限制。但是近年來，隨著實驗操作技術的改進和自動化程度的提高，同時采用表型、等位酶等基因表達結果類遺傳標記分析方法，以及多種DNA分子標記手段，對同一套試驗材料和進行綜合評價，以求獲得對研究材料更為深入的理解，正在逐漸成為一種發展趨勢[10]，而且通過不同類型研究方法得到的結果有些情況下可能比較吻合，有些卻會展現出較大差異。因此，如何對不同方法得到的結果進行綜合評價，是遺傳多樣性分析中出現的新課題。

任何遺傳多樣性的研究方法都是從特定的角度進行探討，各自有其理論上或者實際應用上的優點和缺點。但毫無疑問的是任何一種檢測遺傳多樣性的方法本身都存在一定程度上的局限性，目前來說還找不到一種可以完全替代其他方法的技術，也即沒有一種方法可以完美解決所有問題。因此，可以說用任何一種遺傳標記方法分析得到的遺傳多樣性參數結果都具有一定的片面性，無論該分析手段多么先進。如果要想更深入、全面、準確地了解羅非魚良種選育群體的遺傳多樣性狀況，只有盡可能地采取多種遺傳多樣性分析方法進行聯合分析，以實現不同方法間的相互彌補和綜合從而獲得完整的遺傳多樣性信息。

2.2.2 不同標記分析群體遺傳多樣性時的橫向比較研究 李瑩瑩[11]綜合研究了牡丹遺傳多樣性分析與品種鑒定中分子標記的應用情況，發現同時應用兩類不同分子標記方法對牡丹資源進行橫向對比的報道幾乎為空白，新型目的基因分子標記研究對傳統DNA分子標記提供了補充，提出應當加強不同標記技術在牡丹資源研究中的聯合應用。羅非魚良種選育研究中不同類型分子標記間的橫向對比研究同樣接近于空白[12-13]。在新吉富羅非魚選育群體mtDNA Cytb和D-loop基因序列特征分析的基礎上，筆者基于學界對于兩種技術所得到的遺傳變異數據之間關系所知無幾的嚴峻狀況，開展了羅非魚良種選育群體源于Cytb和D-loop基因的序列遺傳變異和遺傳結構對比分析，以期為針對不同種類經濟動植物優良品種育種對象，選擇不同的遺傳標記分析方法，以及擴展研究結果之間橫向比較提供方法上的參考，使得研究結果相比較更加逼近客觀事實，加強研究結果的應用價值。

以新吉富羅非魚選育群體F0、F6～F9共5代為材料，基于SSR方法和AFLP方法，按SSR/AFLP分別計算得到的5個選育群體間Nei（1978）相似性系數比率及遺傳距離比率結果如表1所示。

表1 群體間Nei相似性系數（1978）比率（右上角）及遺傳距離比率（左下角）

從表1中可以看出群體間SSR/AFLP遺傳相似性比率有很好的穩定性，群體間SSR/AFLP遺傳距離比率全都遠大于1，具有良好的區分度。眾多類似研究也表明SSR具有多態性高、重復性好等特點，尤其是適用于其他標記類型揭示變異水平低的物種[14]。結合微衛星相比較更加便捷高效的優勢，就建立優良品種選育群體的常規遺傳多樣性水平檢測工具而言，SSR為更適宜于羅非魚選育群體遺傳多樣性常規檢測的分析方法。

2.2.3 不同標記聯合用于建立遺傳連鎖圖譜 聯合應用不同遺傳標記，目前已經建立一些具有重要經濟性狀養殖品種的遺傳連鎖圖譜。Kocher[15]對于尼羅羅非魚率先建立遺傳連鎖圖譜，其作圖群體采用的是來自一個母本的41個單倍體胚胎組成的家系，由62個微衛星標記和112個AFLP標記構成30個連鎖群，平均23.5 cM，總圖距為1 000～2 000 cM。Agresti[16]采用三雜交羅非魚（以奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚的雄性雜交子一代作父本，雌性莫桑比克羅非魚作母本）構建作圖群體，共得到214個分離的標記（包括60個微衛星位點，154個AFLP位點），組成24個連鎖群。McConnell[17]報道了采用尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚雜交子代為作圖群體，得到9個微衛星標記構成4個連鎖群。

3 展 望

各種遺傳標記的大量應用在羅非魚良種選育實踐中發揮了重要作用。然而對于基因定位和QTL作圖來說，現有文獻中能提供的遺傳連鎖圖譜精細度需要持續不斷的大幅度提高，目前已經開發出來的遺傳標記數量還遠遠不能滿足羅非魚遺傳標記輔助育種生產實踐的需求。

隨著基因測序技術的飛速發展，DNA測序進入個體特異性測序新階段。順應國際研究潮流，未來羅非魚育種遺傳標記相關研究主要應當從以下幾個方面來考慮。（1）DNA序列多態性技術。由于測序成本的大幅度下降，DNA序列多態性分析在操作上越來越簡單易行，未來將成為遺傳多樣性分析的主要工具之一。一些細胞器如線粒體DNA[18-19]，因其進化快速的特征而成為羅非魚良種選育中DNA序列多樣性分析的首選。（2）目前國際主要的生物信息數據庫允許各研究機構隨時提交各種序列，海量DNA序列信息被累積儲存于各個大型公共數據庫。因此，充分利用公開DNA序列信息開發新標記是相對而言更為經濟有效的方法。比如與傳統尋找微衛星的方法相比，Varshney于2005年指出EST-SSR更為簡捷快速[20]。2003年開發的目標區域擴增多態性（TRAP）標記技術，具有簡單、高通量的優勢[21]。馬慶男等[22]建立了羅非魚TRAP分子標記反應體系，豐富了羅非魚遺傳多樣性評價、種質鑒定、分子標記輔助育種等研究手段。1996年開發的cDNA-AFLP 技術[23]，在研究cDNA差異顯示的同時，還可以揭示基因的功能。2007年Begge提出功能標記的概念[24]，即從影響特定遺傳性狀變異的基因功能域開發分子標記，可以預計其應用于標記輔助選擇育種可有效提高選擇效率。這些基于測序與生物信息學技術開發的分子標記技術必將在羅非魚良種選育研究領域發揮重要的作用。

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（責任編輯：高國賦）

Application and Prospect of Genetic Markers in Tilapia Breeding

XIE Xiao-yong1，ZHONG Jin-xiang2，ZHAO Jin-liang3
（1. Key Lab. of Fishery Ecology and Environment, Guangdong Province, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, PRC; 2. Fishery Technical Extension Center of Guangdong, Guangzhou 510220, PRC; 3. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, PRC）

In this paper, the application of the traditional genetic marker tilapia breeding in recent years was reviewed. The necessity of the combined analysis of several molecular markers was pointed out. The similarity coefficient ratios of Nei (1978) calculated respectively by SSR/AFLP were between 0.942 07 and 0.963 70 in the tilapia breeding population, meanwhile the genetic distances ratios of Nei (1978) calculated by SSR/AFLP among populations were much larger than 1, which revealed the discrimination ability of SSR. Based on several factors, SSR was recommended as a routine monitoring method for genetic diversity of Tilapia breeding. And it was pointed out that the new type of molecular marker based on DNA sequencing and bioinformatics development should be the focus of the future study of tilapia breeding.

tilapia; genetic marker; breeding; riview

Q347

：A

：1006-060X（2017）02-0123-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.002.031

2016-11-03

國家“十五”攻關項目（2001BA505B0513）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（2007TS04）

頡曉勇（1976-），男，甘肅天水市人，副研究員，研究方向為水產動物種質資源與養殖技術研究。