宮腔粘連子宮內膜組織中ArhGAP29、E-cadherin的表達及意義

徐 倩，段 華，汪 沙，甘 露，付鳳仙，湯一群

宮腔粘連子宮內膜組織中ArhGAP29、E-cadherin的表達及意義

徐 倩，段 華，汪 沙，甘 露，付鳳仙，湯一群

目的探討 ArhGAP29和 E-cadherin在宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUAs）子宮內膜組織中的表達及其臨床意義，分析 ArhGAP29、E-cadherin在 IUAs發病中的作用機制。方法采用免疫組化 PV 9000兩步法檢測 IUAs中 ArhGAP29、E-cadherin的表達，分析其與 IUAs的臨床病理特征關系以及 ArhGAP29、E-cadherin的相關性。結果（1）ArhGAP29、E-cadherin在正常子宮內膜中表達的免疫組化反應評分（immunoreactive score，IRS）高于 IUAs患者，差異有統計學意義（P＝0.017，P＝0.004）；（2）中度 IUAs患者子宮內膜中 ArhGAP29、E-cadherin表達的IRS高于重度 IUAs患者，差異有統計學意義（P＝0.020，P＝0.026）；非閉經 IUAs患者子宮內膜 ArhGAP29、E-cadherin表達的 IRS高于閉經 IUAs患者，差異有統計學意義（P＝0.019，P＝0.031）；（3）ArhGAP29表達降低與E-cadherin低表達之間呈顯著正相關（r＝0.725，P＜0.001）。結論 ArhGAP29、E-cadherin在 IUAs子宮內膜中表達降低，其下降程度與IUAs嚴重程度有關，ArhGAP29、E-cadherin降低可能參與 IUAs的形成。

宮腔粘連；ArhGAP29；E-cadherin；上皮－間質轉化；免疫組織化學

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUAs）又稱Asherman綜合征，是指宮腔或者宮頸管的部分或全部閉塞［1］，其發病機制尚不明確。目前研究認為，上皮 －間質轉化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）是 IUAs的可能發病機制之一［2－3］，子宮內膜基底層損傷后，上皮細胞再生障礙，其在形態上發生向間（充）質細胞表型的轉變并獲得遷移能力，導致成纖維細胞增生以及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積，粘連瘢痕形成。上皮標志物E-cadherin表達降低是EMT過程中最顯著的細胞表型改變［4－5］。ArhGAP29通過調節 RhoGTP酶活性，影響 EMT相關疾病的發展和轉歸，其在細胞黏附、細胞-ECM黏附以及肌動蛋白重排中的作用已得到證實［6－7］，但在 IUAs中的作用鮮有報道。本文檢測子宮內膜組織中 ArhGAP29及 E-cadherin的表達情況，分析其與IUAs臨床病理特征的相關性，以探討其在 IUAs發病機制中可能發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2014年7月～2015年6月北京婦產醫院收治的IUAs子宮內膜組織標本 39例，患者年齡23～40歲，中位年齡33歲；采用美國生育協會（AFS）IUAs評分系統，其重度IUAs患者 17例，中度IUAs患者22例；增殖期內膜15例，分泌期內膜24例；就診主訴為不孕 8例，月經減少 24例，閉經7例；粘連性質為膜性8例，纖維性26例，肌性5例；輸卵管開口雙側可見21例，一側可見 13例，雙側不可見 5例；子宮發育正常 28例，合并子宮發育不良或子宮發育異常11例；刮宮次數＜3次者33例，≥3次者6例。正常子宮內膜組織取自同期輸卵管性不孕患者診刮子宮內膜組織，正常子宮內膜組織26例，年齡27～40歲，中位年齡為32歲，診刮病理證實為正常子宮內膜增殖期 12例，分泌期14例。

1.2 試劑與儀器鼠抗人單克隆抗體ArhGAP29 （1∶500，NOVUS，Australia），兔抗人 E-cadherin多克隆抗體（1∶200，Abcam，USA），PV 9000兩步法染色試劑及濃縮型 DAB試劑盒（北京中杉金橋公司），60℃烤箱、二甲苯、乙醇、EDTA、高壓鍋、濕盒、倒置顯微鏡（OLYMPUS，JAPAN）。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用 PV 9000兩步法，組織切片5μm厚，脫蠟水化后采用 EDTA（pH9.0）修復抗原；3%H2O2去離子水孵育10 min，滴加一抗，ArhGAP29、E-cadherin抗體稀釋比例分別為1∶500、1∶200，4℃過夜，滴加聚合物增強劑（polymer helper）孵育20 min，滴加二抗（polyperoxidase）孵育后應用 DAB溶液顯色。

1.4 結果判讀免疫組化結果根據 Remmele和Stegner提出的免疫組化反應評分（immunoreactive score，IRS）標準進行判讀：IRS＝染色強度 ×陽性細胞百分比。ArhGAP29蛋白以細胞核周呈棕黃色染色為陽性細胞，E-cadherin蛋白以細胞膜呈棕黃色染色為陽性細胞，著色境界清晰，突出于背景。染色強度評分：0分為（－）、1分為（＋）、2分為（?）、3分為（?）。陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分、1%～50%陽性細胞為2分；51% ～100%陽性細胞為3分。每個切片隨機選取10個視野進行評分，其平均值作為此樣本的最終 IRS［8］。

1.5 統計學分析采用 SPSS 17.0軟件進行統計學分析，連續性變量組間均值采用獨立樣本 t檢驗，分析蛋白表達與 IUAs患者臨床因素的相關性采用獨立樣本 t檢驗，蛋白表達采用 Spearman相關性分析。統計檢驗均為雙側，檢驗水準為 α＝0.05。

2 結果

2．1 ArhGAP29、E-cadherin在正常組及 IUAs子宮內膜中的表達免疫組化結果顯示，ArhGAP29多表達在核周胞質中，并呈點狀模式，子宮內膜腺上皮及間質上皮細胞均有表達（圖1）；E-cadherin陽性多位于子宮內膜腺上皮細胞膜，細胞與細胞間的連接處較為明顯（圖2）。ArhGAP29、E-cadherin在正常子宮內膜組織中表達的 IRS分別為6.36±2.16、7.71±1.51；在 IUAs患者子宮內膜組織中表達的IRS分別為 2.62±1.55、2.79±1.28，低于正常組，兩者差異有統計學意義（P＝0.017，P＝0.004）。

2．2 ArhGAP29、E-cadherin表達與 IUAs臨床病理特征的關系中度及重度 IUAs患者中，Arh-GAP29表達的 IRS分別為 3.18±1.62、1.88± 1.11，差異有統計學意義（P＝0.020）；E-cadherin表達的IRS分別為3.43±1.20、1.88±0.72，差異有統計學意義（P＝0.026）。在非閉經及閉經 IUAs患者中，ArhGAP29表達的 IRS分別為2.81±1.58、1.71 ±1.11，差異有統計學意義（P＝0.019）；E-cadherin表達的IRS分別為3.03±1.28、1.71±0.49，差異有統計學意義（P＝0.031）。E-cadherin表達的 IRS在膜性、纖維性及肌性粘連中分別為3.88±1.73、2.65±1.02及 1.80±0.45，差異有統計學意義（P ＝0.008）；其IRS在輸卵管開口雙側可見、單側可見及雙側不可見的患者中分別為 3.29±1.31、2.31± 0.95及 2.00±1.23，差異有統計學意義 （P＝0.027）。提示ArhGAP29、E-cadherin的表達同 IUAs的嚴重程度及患者是否閉經有關，重度及閉經患者

圖1 ArhGAP29在不同子宮內膜中的表達，PV 9000兩步法：A.正常子宮內膜；B.中度IUAs；C.重度IUAs

圖2 E-cadherin在不同子宮內膜中的表達，PV 9000兩步法：A.正常子宮內膜；B.中度 IUAs；C.重度 IUAs其蛋白表達水平較低；E-cadherin的表達同刮宮次數、粘連性質及輸卵管開口情況亦可能有相關性，刮宮次數≥3次、肌性粘連及雙側輸卵管開口不可見的患者，其E-cadherin表達水平較低（表1）。

表1 ArhGAP29、E-cadherin的表達與IUAs臨床病理特征的關系

2．3 ArhGAP29、E-cadherin蛋白表達的相關性將ArhGAP29與E-cadherin表達的IRS進行Spearman相關性分析顯示，兩者的表達呈顯著正相關（r＝0.725，P＜0.001）。

3 討論

IUAs引起的不孕、反復流產、早產、前置胎盤、胎盤粘連或胎盤植入等并發癥已嚴重威脅女性的生殖健康，由于其發病機制尚不明確，重度 IUAs患者治愈困難，復發率高。目前研究認為，上皮細胞在發育過程中可能受炎癥等刺激發生 EMT過程，轉變為纖維母細胞，因此 EMT可能在 IUAs形成過程中發揮作用。

ArhGAP29是一種 GTP酶活化蛋白（GAP），是EMT發生的重要調控分子，其基因定位于人類染色體1p22.1，具有RhoA的GAP結構域，與RhoA具有很強的親和力，是 RhoA活性的關鍵調節因子。RhoA是小 G蛋白超家族的亞族成員，具有 GTP酶活性，是細胞表面受體同胞內多種信號蛋白的中介。ArhGAP29可使RhoA由GTP限制型轉變為GDP限制型而失活，進一步影響下游效應分子 ROCK，調節細胞動力學和肌動蛋白細胞骨架，影響細胞分裂及細胞周期，改變上皮細胞極性的穩定性，參與 EMT過程的調控［9］。本組免疫組化結果顯示，ArhGAP29在子宮內膜腺上皮及間質上皮細胞均有表達，并呈點狀模式表達在核周胞質中。ArhGAP29在 IUAs患者子宮內膜組織中表達低于正常子宮內膜組織中的蛋白表達水平，提示在 IUAs的發病過程中，子宮內膜細胞發生細胞骨架的改變，最終導致子宮內膜纖維化改變。

E-cadherin是鈣依賴性的跨膜蛋白，普遍存在于上皮細胞、胎盤及間胚層細胞中，主要介導同一種細胞之間的黏附，多表達在細胞與細胞連接處。對于維持上皮細胞的極性、完整性及細胞分化非常重要［10］。發生 EMT的上皮細胞中，間質細胞標志物增多，加強細胞接觸的 E-cadherin及 β-連環蛋白等表達降低［11］，本組結果顯示E-cadherin的陽性多位于子宮內膜腺上皮細胞膜，細胞與細胞間的連接處較為明顯，其在 IUAs子宮內膜組織中表達的顯著低于正常子宮內膜組織，與 Li等［2］在動物 IUAs實驗中結論一致。

ArhGAP29、E-cadherin的表達與 IUAs的嚴重程度及患者是否閉經有關，重度及閉經患者其蛋白表達水平較低；E-cadherin的表達同刮宮次數、粘連性質及輸卵管開口情況亦顯示出相關性，刮宮次數≥3次、肌性粘連及雙側輸卵管開口不可見的患者，其E-cadherin表達水平較低。提示機械刺激越大，子宮內膜的損傷程度越重，子宮內膜發生 EMT細胞骨架改變的概率和程度就越大。IUAs臨床診療中國專家共識也強調了殘留子宮內膜面積對于治療反應的重要性，并指出對于內膜嚴重破壞、幾乎沒有正常內膜殘存的重度 IUAs患者，藥物治療反應較差［12］，從而也提示正常內膜越少，越有可能發生分子水平病變，導致其內膜反應性及修復能力差。

子宮內膜纖維化是導致IUAs預后不良的關鍵原因，組織損傷修復過程中，多種細胞（如上皮細胞、周細胞等）可通過EMT轉化為成纖維細胞，使其成為纖維化疾病發生、發展過程中的主要效應細胞。已有文獻報道提示子宮內膜纖維化的形成與 EMT關系密切，但其分子機制仍未闡明。本組結果顯示，ArhGAP29與 E-cadherin表達呈顯著性正相關，提示在IUAs形成過程中，子宮內膜細胞中ArhGAP29、E-cadherin的表達量降低協同發揮作用，促使細胞骨架改變、內膜細胞極性及完整性破壞，導致子宮內膜的纖維化改變。深入分析子宮內膜上皮細胞發生EMT的分子機制，有助于尋找子宮內膜纖維化改變的重要分子靶點，從而為逆轉或減輕 IUAs纖維化病變提供新的診療思路。

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Expression and significance of ArhGAP29 and E-cadherin in intrauterine adhesions of endometrium

XU Qian，DUAN Hua，WANG Sha，GAN Lu，FU Feng-xian，TANG Yi-qun
（Department of Gynecology Minimally Invasive Center，Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100006，China）

PurposeTo investigate the expression and significance of ArhGAP29 and E-cadherin in endometrial tissue of intrauterine adhesions（IUAs）and to explore their roles in the pathogenesis of IUAs.MethodsThe expression of ArhGAP29 and E-cadherin was detected by immunohistochemical PV 9000 two-step method.The correlation between ArhGAP29 and E-cadherin expression and clinical features was analyzed.Results（1）The immunoreactive score（IRS）of ArhGAP29 and E-cadherin in normal endometrial tissuewere higher than those in IUAs endometrial tissue（P＝0.017，P＝0.004）.（2）IRS of Arh-GAP 29 and E-cadherin in moderate IUAs patients were higher than that in severe IUAs patients（P＝0.020，P＝0.026）.In IUAs patientswithout amenorrhea，the IRSof ArhGAP29 and E-cadherin were higher（P＝0.019，P＝0.031）than that in IUAs patients with amenorrhea.（3）The decrease of ArhGAP29 expression had a significantly parallel relationship with the negative expression of E-cadherin（r＝0.725，P＜0.001）.ConclusionThe expression of ArhGAP29 and E-cadherin decreases in endometrial tissue of IUAs patients，which is related with degree of IUAs severity.ArhGAP29 and E-cadherinmay participate in the IUAs formation.

intrauterine adhesions；ArhGAP29；E-cadherin；epithelial-mesenchymal transition；immunohistochemistry

R 711.74

A

1001－7399（2017）01－0004－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.002

接受日期：2016－11－12

國家科技支撐計劃（2014BAI05B03）、首都衛生發展科研專項經費資助（2014-1-2112）、北京市醫院管理局臨床醫學發展專項經費資助（ZYLX201406）

首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科微創中心，北京100006

徐 倩，女，博士研究生。Tel：（010）52277666，E-mail：qyxuqian1989＠163.com 段 華，女，博士，主任醫師，通訊作者。E-mail：duanhuasci＠163.com