子宮頸鱗狀細胞癌中Lgr5的表達及其臨床意義

錢 萍，高寶蓮

子宮頸鱗狀細胞癌中Lgr5的表達及其臨床意義

錢 萍，高寶蓮

目的探討富含酪氨酸重復序列 G蛋白偶聯(lián)受體（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5）在子宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）中的表達及意義。方法采用免疫組化 EnVision兩步法檢測83例CSCC組織、56例癌旁正常組織及32例子宮頸上皮內病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）組織中 Lgr5蛋白表達，并應用 RT-PCR檢測13例 CSCC及癌旁組織中 Lgr5 mRNA的表達，分析 Lgr5表達與CSCC臨床病理特征的關系。結果Lgr5在CSCC中的表達明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01）及CIN（P＜0.05）。Lgr5表達與腫瘤分化程度（P＜0.01）和浸潤深度（P＜0.05）有關，與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期及淋巴結轉移無關（P＞0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，Lgr5高表達者 5年生存率顯著低于 Lgr5低表達者（P＜0.01）。多因素 Cox比例風險回歸模型分析顯示，Lgr5的表達（P＝0.027）可以作為判斷CSCC患者預后的獨立危險因素。結論Lgr5的表達與腫瘤分化程度和浸潤深度密切相關，可能參與CSCC的發(fā)生、發(fā)展，可作為 CSCC患者預后判斷的輔助指標。

子宮頸腫瘤；鱗狀細胞癌；Lgr5；臨床病理學

Lgr5是G蛋白耦聯(lián)受體的一種，廣泛分布于人體組織中，在胃腸道、乳腺、大腦、脊髓、毛囊及生殖系統(tǒng)等均有表達［1－2］。研究表明，Lgr5是腸道干細胞［3］和毛囊干細胞［4］的標志物，并參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5－6］。目前，有關 Lgr5在子宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）中的表達及臨床意義鮮有報道。本文采用免疫組化 En-Vision兩步法和 RT-PCR檢測 Lgr5在 CSCC及癌旁正常組織中的表達，分析 Lgr5表達與 CSCC臨床病理特征的關系，為臨床治療及預后判斷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集我院2005～2010年手術切除CSCC組織83例及癌旁正常組織56例，并收集同時期子宮頸上皮內病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）標本32例，其中低級別CIN 19例，高級別CIN 13例。CSCC患者年齡 26～78歲，平均 48.6歲，＜50歲者51例，≥50歲者32例。腫瘤直徑＜3 cm者49例，≥3 cm者34例；根據(jù)2009年國際婦產(chǎn)科協(xié)會（FIGO）分期標準：Ⅰ～Ⅱa期46例，Ⅱb～Ⅳ期37例；分化程度：高分化19例，中分化 31例，低分化33例；83例均行盆腔淋巴結清掃術，其中有淋巴結轉移者32例，無淋巴結轉移者51例；浸潤程度以腫瘤浸潤子宮頸肌層≤1／2為淺浸潤，＞1／2為深浸潤，其中淺浸潤38例，深浸潤45例。所有病例術前均未行放、化療及免疫治療，具有完整的臨床病理及隨訪資料。另選取 CSCC及新鮮正常子宮頸組織各13例，用于RT-PCR檢測。兔抗人Lgr5多克隆抗體購自美國Abcam公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；RT-PCR實驗所需的 RNAiso Plus、RT及 PCR試劑盒均購自 Takara公司，引物序列由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 所有標本均經(jīng) 10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，免疫組化染色采用EnVision兩步法（DAKO公司），Lgr5蛋白工作液濃度為1∶100，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，以PBS代替一抗作陰性對照，用公司提供的陽性切片作陽性對照。依據(jù)細胞染色強度和陽性細胞百分比判斷結果［7］。染色強度按著色細胞判斷：無陽性染色、淺黃色、棕黃色、黃褐色依次計為0、1、2、3分；陽性細胞百分比判斷標準：陽性細胞數(shù) ＜5% 為0分，5%～20%為1分，21%～50%為2分，51% ～80%為3分，＞80%為4分；將上述兩項得分結果相乘：≥6分為陽性。

1.2.2 RT-PCR 用 Trizol RNA提取試劑盒提取組織 RNA并檢測其濃度，OD260／OD280在 1.8～2.0之間。在37℃孵育15 min，85℃孵育5 s條件下將RNA逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green熒光染料，參照試劑盒說明書完成 RT-PCR反應，反應條件：95℃預變性1min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，60℃延伸 30 s，合計 40個循環(huán)。結果采用相對定量用2－ΔΔCt法計算，Lgr5引物上游序列：5′-GATGTTGCTCAGGGTGGACT-3′，下游序列：5′-GGGAGCAGCTGACTGATGTT-3′；內參 actin引物上游序列：5′-GCACCCAGCACAATGAAGA-3′，下 游 序 列：5′-CGATCCACACGGAGTACTTG-3′。

1.3 統(tǒng)計學方法應用 SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有計數(shù)資料比較均采用 χ2檢驗，配對資料采用 t檢驗，采用 Kaplan-Meier、Log-rank法分別繪制和比較生存曲線，采用 Cox比例風險回歸模型分析影響患者預后的獨立危險因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 Lgr5在不同子宮頸組織中的表達Lgr5蛋白陽性染色主要定位于細胞膜和細胞質，Lgr5在65例CSCC組織中呈陽性，陽性率為78.3%（65／83）；在大部分癌旁組織中呈陰性，僅在8例癌旁正常組織中呈弱陽性，陽性率為14.3%（8／56），兩組相比差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝54.97，P＜0.01，表1）。Lgr5在低級別及高級別 CIN中的陽性率分別為 36.8% （7／19）、46.2%（6／13），均顯著低于 CSCC組（P均＜0.05，表1，圖1）。

表1 Lgr5在不同子宮頸組織中的表達

2．2 RT-PCR檢測采用相對定量 2－ΔΔCt法計算Lgr5 mRNA在 CSCC及癌旁正常組織中的表達，CSCC中Lgr5 mRNA的表達水平為0.91±0.05，癌旁正常組織中Lgr5 mRNA的表達水平為0.33± 0.04，CSCC組織中 Lgr5基因表達明顯高于癌旁正常組織（t＝9.242，P＜0.01，圖2）。

2．3 Lgr5表達與 CSCC臨床病理特征的關系Lgr5表達與腫瘤分化程度（χ2＝7.88，P＜0.01）、浸潤深度（χ2＝6.47，P＜0.05）相關，與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期及淋巴結轉移無關（P均＞0.05，表2）。

圖1 A.CSCC組織中 Lgr5呈強陽性，EnVision兩步法；B.癌旁子宮頸組織中 Lgr5呈陰性，EnVision兩步法；C.低級別CIN累及腺體組織中 Lgr5呈弱陽性，EnVision兩步法；D.高級別CIN累及腺體組織中Lgr5呈陽性，EnVision兩步法

圖2 RT-PCR檢測Lgr5 m RNA的表達

2．4 Lgr5表達與 CSCC患者預后的關系Lgr5陽性組患者的中位生存時間為27個月，顯著低于陰性組的39個月（P＝0.036，圖3）。多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，F(xiàn)IGO分期（P＝0.004）、淋巴結轉移（P＝0.012）和 Lgr5的表達（P＝0.027）可以作為判斷 CSCC患者預后的獨立危險因素。

3 討論

近年來子宮頸癌發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢，其發(fā)生是一個多階段、多步驟的復雜過程，與細胞生長周期調節(jié)失衡、信號傳導系統(tǒng)紊亂、癌基因和抑癌基因的表達異常等均存在密切的關系。研究表明：Wnt信號通路的異常活化在細胞癌變、腫瘤發(fā)生及腫瘤侵襲過程中具有重要作用，已發(fā)現(xiàn)在人類多種惡性腫瘤中存在異常 Wnt蛋白信號［8］，Lgr5作為Wnt信號通路中 β-連環(huán)蛋白 TCF-4的靶基因，其表達的上調或下調，可能在細胞的增殖、分化和腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［9］。

表2 Lgr5表達與 CSCC臨床病理特征的關系

圖3 Lgr5陽性組和陰性組 CSCC患者的生存曲線

Lgr5在人體小腸底部隱窩基底柱狀細胞、結腸隱窩、胃腺體底部及毛囊中均有不同程度的表達，可作為多種人體組織干細胞的標志物。近年文獻報道，Lgr5基因可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Becker等［10］采用免疫組化法觀察胃腸道正常組織和癌前病變組織中Lgr5的表達，發(fā)現(xiàn)癌前病變組織中 Lgr5的表達顯著高于癌旁正常組織，且在正常胃腸組織中 Lgr5的表達局限于隱窩基底部，而在癌前病變組織中 Lgr5的表達并不局限于隱窩基底部，提示 Lgr5離開隱窩基底部是腫瘤形成和惡化的早期事件。在肝細胞癌中，Yamamoto等［11］發(fā)現(xiàn) Lgr5 mRNA在肝細胞癌組織中的表達顯著高于癌旁正常肝組織；將突變的β-連環(huán)蛋白導入培養(yǎng)的小鼠肝細胞中，會引起小鼠 Lgr5的上調。由此推測，Lgr5參與肝癌的生成，并且很可能是被 Wnt信號途徑激活的目標基因。另外，有文獻報道在基底細胞癌［12］、卵巢癌［13］及食管癌［9］中 Lgr5均過表達，揭示Lgr5與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。

本實驗采用免疫組化EnVision兩步法及 RTPCR檢測Lgr5在 CSCC和癌旁組織及CIN中的表達，結果顯示：Lgr5蛋白陽性部位主要位于細胞膜和細胞質，Lgr5在腫瘤組織中陽性率為78.3%，在癌旁正常組織中陽性率為 14.3%，Lgr5在 CSCC組織中的表達顯著高于癌旁組織及CIN；RT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，CSCC組織中 Lgr5基因表達也明顯高于癌旁正常組織。進一步分析Lgr5蛋白表達與CSCC臨床病理特征的關系后發(fā)現(xiàn)，Lgr5表達與 CSCC分化程度及浸潤深度有關；與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期及淋巴結轉移無關，腫瘤分化程度越低，浸潤深度越深，Lgr5的陽性強度越高。Sun等［14］對 94 例 CSCC的分析中發(fā)現(xiàn)，Lgr5在腫瘤組織中的表達明顯高于癌旁組織，并且與腫瘤大小和有無宮旁浸潤密切相關。由此推測，Lgr5可能參與 CSCC的發(fā)生，并對病變的發(fā)展有一定的促進作用。

既往研究證實，在多種腫瘤如食管腺癌［9］、腦膠質細胞瘤［15］及軟組織肉瘤［16］中，Lgr5表達增加與腫瘤的進展及不良預后密切相關。本實驗通過Kaplan-Meier生存分析同樣發(fā)現(xiàn)，Lgr5高表達患者5年生存率顯著低于 Lgr5低表達患者；并且多因素Cox回歸分析證實，Lgr5的高表達率與 CSCC不良預后相關。提示 Lgr5可作為判斷 CSCC患者預后的獨立因素，進一步分析其在促進腫瘤發(fā)展中的分子作用機制，有望成為 CSCC治療的新靶點。

Lgr5在 CSCC組織中的過表達揭示了其在CSCC發(fā)生、發(fā)展中的促進作用，但有關 Lgr5在不同信號途徑中發(fā)揮作用的機制及 Lgr5細胞能否代表CSCC腫瘤干細胞等問題，還有待于進一步的實驗來證實。

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Expression of Lgr5 in cervical squamous cell carcinoma and its significance

QIAN Ping，GAO Bao-lian
（Department of Pathology，Traditional Chinese Medicine Hospital of Jiaxing City，Jiaxing 314001，China）

PurposeTo investigate the expression of Lgr5 in cervical squamous cell carcinoma（CSCC）and its significance.MethodsLgr5 protein expression was evaluated by immunohistochemistry of EnVision two-step in 83 paraffin-embedded CSCC specimens，56 normal cervical tissues specimens and 32 cervical intraepithelial neoplasia（CIN）specimens.The expression of Lgr5 mRNA was evaluated by RT-PCR in 13 pairs of surgically removed CSCC and adjacent normal cervical tissues. The correlation between Lgr5 expression and clinicopathological features were statistically analyzed.ResultsThe positive proportion of Lgr5 protein in CSCC tissues was significantly higher than those in adjacent normal cervix（P＜0.01）and CIN（P＜0.05）.The expression of Lgr5 in CSCC tissues was associated with grade of tumors（P＜0.01）and depth of invasion（P＜0.05），but not associated with age，tumor size，clinical stage and lymph nodemetastasis（P＞0.05）.Kaplan-Meier analysis showed that the 5-year survival rate of patients with Lgr5 overexpression was significantly lower than thatof patientswith lower expression（P＜0.01）.ConclusionThe expression of Lgr5 in CSCC tissuesmay associated with grade of tumors and depth of invasion and may be involved in initiation and development of CSCC，and itmay be a new assistant marker for prognosis of CSCC.

cervix neoplasm；squamous cell carcinoma；Lgr5；clinical pathology

R 737.33

A

1001－7399（2017）01－0042－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.011

接受日期：2016－11－21

浙江省嘉興市中醫(yī)醫(yī)院病理科 314001

作者單位：錢 萍，女，副主任醫(yī)師。E-mail：3539405730＠qq.com