乳腺癌中BCL-6和ZEB2的表達及其意義

鄭 麗，趙 敏，昂 琳，黃 金，王 瑾，鄒 強，吳正升

乳腺癌中BCL-6和ZEB2的表達及其意義

鄭 麗1，趙 敏1，昂 琳1，黃 金1，王 瑾1，鄒 強1，吳正升2

目的探討 BCL-6和 ZEB2在乳腺癌侵襲、轉移及預后中的生物學意義。方法分別采用免疫組化 SP兩步法與原位雜交法檢測228例乳腺癌和80例乳腺良性病變組織中BCL-6、ZEB2蛋白及mRNA的表達。結果乳腺癌組織中 BCL-6、ZEB2蛋白及 mRNA表達水平均顯著高于乳腺良性病變組織（P＜0.05）；BCL-6表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、組織學分級、TNM分期及 HER-2表達均呈正相關（P＜0.05）；ZEB2表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期及 HER-2表達均呈正相關（P＜0.05）；乳腺癌中 BCL-6、ZEB2陽性者總生存期及無復發生存期均顯著低于陰性者（P＜0.01）。結論BCL-6、ZEB2與乳腺癌演進過程密切相關，檢測 BCL-6和ZEB2的表達，有望成為監測與預警乳腺癌侵襲、轉移及預后的重要手段。

乳腺腫瘤；BCL-6；ZEB2；免疫組織化學；原位雜交

乳腺癌是全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤術后復發與轉移是導致乳腺癌患者死亡的主要原因。建立有效的監測和預警乳腺癌侵襲、轉移的手段，及早進行針對性干預治療，對改善患者預后及提高患者生活質量具有十分重要的意義。腫瘤細胞上皮－間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺惡性腫瘤演進過程中發揮主要作用，多種調控因子參與EMT的發生，如ZEB1、 ZEB2、TGFβ、VEGF等。有文獻報道［1］BCL-6也可促進乳腺癌細胞發生 EMT。本文分別采用免疫組化 SP兩步法和原位雜交法檢測乳腺癌及乳腺良性病變組織中BCL-6、ZEB2蛋白及mRNA的表達，探討兩者在乳腺癌侵襲、轉移及預后中的生物學意義。

1 材料與方法

1.1 材料選取合肥市第二人民醫院病理科和安徽醫科大學第一附屬醫院病理科 2004年 5月 ～2014年11月手術切除的女性浸潤性乳腺癌標本228例。患者年齡33～83歲，中位年齡58歲；根據WHO（2012）乳腺腫瘤分級標準：Ⅰ級 19例、Ⅱ級141例、Ⅲ級68例；根據國際抗癌聯盟 TNM乳腺腫瘤分期標準：Ⅰ期9例、Ⅱ期110例、Ⅲ期98例、Ⅳ期 11例。患者術前均未接受過放、化療或免疫治療，其中197例患者具有完整的生存隨訪資料，中位隨訪時間為60個月。另收集同期手術切除的女性乳腺良性病變組織80例（其中乳腺腺病41例、乳腺纖維腺瘤33例、乳腺導管上皮普通型增生6例）；年齡16～58歲，中位年齡37歲。

1.2 試劑

1.2.1 免疫組化試劑 兔抗人多克隆抗體BCL-6（濃縮型）及鼠抗人單克隆抗體ZEB2（濃縮型）均購自美國Rockville公司。ER、PR、CerbB-2、SP免疫組化檢測試劑盒及 DAB顯色液等均購自上海長島生物公司。

1.2.2 原位雜交試劑 BCL-6及ZEB2 mRNA原位雜交檢測試劑盒均購自武漢博士德公司。所用地高辛標記的寡核苷酸探針序列如下，BCL-6：5′-GACAGCTGTATCCAGTTCACCCGCCATGCCAGTGA-3′，5′-TTCTATAGCATCTTTACAGACCAGTTGAAATGCA A-3′，5′-ATCCTGCAGATGGAGCATGTTGTGGACAG TTGCCG-3′；ZEB2：5′-TACTATGCTATGAACATGGA GCCCAACTCCGATGA-3′，5′-AAGGAATTTTCAAATTCAAATAATCTGGACAACAA-3′，5′-ATGAACCGGG CTTACTTGCAGAGCATTACCCCTCA-3′。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測 BCL-6、ZEB2蛋白的表達

采用免疫組化 SP兩步法檢測BCL-6、ZEB1蛋白在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達。BCL-6抗體使用濃度為1∶100，ZEB2抗體使用濃度為 1∶100。選用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.2 原位雜交檢測 BCL-6、ZEB2 mRNA表達切片經脫蠟、水化、3%過氧化氫孵育、胃蛋白酶消化等一系列處理后，滴加地高辛標記的BCL-6或ZEB2探針，40℃恒溫雜交 20 h，生物素化鼠抗地高辛抗體37℃溫浴1 h，鏈霉親和素生物素過氧化物酶復合物（SABC）孵育后DAB液顯色。使用已知陽性切片作陽性對照，探針稀釋液代替探針作陰性對照。

1.4 結果判定BCL-6和ZEB2蛋白染色均主要以細胞核和（或）細胞質呈棕黃色或棕褐色判定為陽性著色。BCL-6和ZEB2 mRNA染色也以細胞核和（或）細胞質呈棕黃色或棕褐色判定為陽性著色。每張切片均選取 5個400倍高倍視野，統計陽性細胞數占腫瘤細胞總數百分比：無陽性細胞或陽性細胞數＜10%，判定為陰性；陽性細胞數≥10%，判定為陽性。

1.5 統計學處理使用 SPSS 13.0軟件進行統計學處理。采用χ2檢驗比較樣本陽性率之間的差異；采用 Kaplan-Meier生存曲線法及 Log-rank檢驗比較組間生存率；采用非參數 Spearman等級相關檢驗分析陽性率與臨床病理參數之間的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 BCL-6和 ZEB2在乳腺癌及乳腺良性病變中的表達

2.1.1 BCL-6和 ZEB2蛋白的表達 228例乳腺癌中125例BCL-6蛋白呈陽性，陽性率為54.8%；80例乳腺良性病變中28例BCL-6蛋白呈陽性，陽性率為35.0%。BCL-6蛋白在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達差異有顯著性（P＜0.05，表1，圖1）。228例乳腺癌中 126例 ZEB2蛋白呈陽性，陽性率為55.3%；80例乳腺良性病變中26例 ZEB2蛋白呈陽性，陽性率為32.5%。ZEB2蛋白在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達差異有顯著性（P＜0.05，表1，圖2）。

表1 BCL-6和 ZEB2蛋白在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達

2.1.2 BCL-6和 ZEB2 mRNA的表達 228例乳腺癌中123例BCL-6 mRNA呈陽性，陽性率為53.9%（圖3）；80例乳腺良性病變中25例BCL-6 mRNA呈陽性，陽性率為31.3%。BCL-6 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達差異有顯著性（P＜0.05，表2）。228例乳腺癌中119例 ZEB2 mRNA呈陽性，陽性率為52.2%（圖 4）；80例乳腺良性病變中26例ZEB2 mRNA呈陽性，陽性率為32.5%。ZEB2 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達差異有顯著性（P＜0.05，表2）。

表2 BCL-6和ZEB2 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達

2．2 BCL-6和 ZEB2表達與乳腺癌臨床病理特征及ER、PR、HER-2相關性分析乳腺癌中BCL-6蛋白表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、組織學分級、TNM分期及 HER-2表達狀況均呈正相關（P＜0.05），與患者年齡及ER、PR表達狀況均無相關性；ZEB2蛋白表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期及HER-2表達均呈正相關（P＜0.05，表3），與患者年齡、組織學分級及ER、PR表達均無相關性。

圖1 BCL-6蛋白在乳腺癌中的表達，SP兩步法 圖2 ZEB2蛋白在乳腺癌中的表達，SP兩步法 圖3 BCL-6 mRNA在乳腺癌中的表達，原位雜交法 圖4 ZEB2 mRNA在乳腺癌中的表達，原位雜交法

2．3 BCL-6與 ZEB2表達與乳腺癌患者生存率的關系采用Kaplan-Meier生存曲線法及Log-rank檢驗分析乳腺癌中 BCL-6和ZEB2蛋白表達與患者總生存率（overall survival，OS）和無復發生存率（root file system，RFS）的相關性。BCL-6蛋白陽性的乳腺癌患者 RFS和 OS均顯著低于其陰性乳腺癌患者（P＝0.002，P＝0.001）。ZEB2蛋白陽性的乳腺癌患者RFS和OS亦顯著低于其陰性乳腺癌患者（P＝0.003，P＝0.001，圖5）。

2．4 乳腺癌中 BCL-6、ZEB2表達的相關性Spearman相關分析表明，BCL-6蛋白表達與 mRNA表達呈正相關性（r＝0.721，P＜0.01），ZEB2蛋白表 達 與 mRNA表 達 呈 正相 關性 （r＝0.747，P＜ 0.01）；BCL-6蛋白表達與 ZEB2蛋白表達呈正相關（r＝0.669，P＜0.01），BCL-6 mRNA表達與 ZEB2 mRNA表達亦呈正相關（r＝0.382，P＜0.01）。

表3 BCL-6和 ZEB2蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

3 討論

BCL-6屬于BTB／POZ轉錄因子家族，編碼核轉錄抑制蛋白，主要功能是抑制細胞轉錄，阻止細胞分化、凋亡，促進其發育、增殖。BCL-6是淋巴系統功能調節的重要因子之一，既往研究［2－3］發現 BCL-6在生發中心B細胞和生發中心來源的 B細胞淋巴瘤中高表達。近年來有文獻報道BCL-6在乳腺癌組織中也呈陽性，并與腫瘤分化、進展密切相關，在乳腺癌分子靶向治療中可能具有潛在價值。多數文獻報道［4－7］BCL-6在乳腺癌組織中高表達，隨腫瘤進展而表達上調，Pinto等［8］則指出 BCL-6蛋白在乳腺癌原發灶中陽性，而在復發、轉移的乳腺癌中表達缺失，與前者結論不同。本組中BCL-6在乳腺癌組織中與乳腺良性病變組織中的表達差異有顯著性，乳腺癌組織中BCL-6明顯高表達，與先前報道結果較一致，且 BCL-6蛋白表達與 mRNA表達呈正相關。乳腺癌中BCL-6蛋白表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、組織學分級、TNM分期和 HER-2表達均呈正相關；而腫瘤大小、淋巴結轉移狀況均是乳腺癌TNM分期的重要因素，TNM分期和組織學分級又與腫瘤生物學行為、預后密切相關，分級、分期越高者，腫瘤進展程度越高、預后越差；乳腺癌 HER-2陽性者，腫瘤細胞惡性程度亦更高，提示 BCL-6在乳腺癌的發生、發展中可能發揮重要作用。本實驗的生存率分析結果顯示，乳腺癌患者中BCL-6陽性者OS 及 RFS均顯著低于 BCL-6陰性者，提示 BCL-6與乳腺癌預后密切相關。

圖5 乳腺癌中 BCL-6、ZEB2蛋白的生存曲線圖

A.BCL-6表達與 RFS；B.BCL-6表達與 OS；C.ZEB2表達與RFS；D.ZEB2表達與OS

ZEB2可通過與E-基因的啟動子上結合，抑制E-cadherin的轉錄，誘導腫瘤細胞EMT的發生，從而增強 腫瘤 的 侵襲、轉移 能 力［9－11］。有 研 究發 現，ZEB2在乳腺癌細胞中表達，且表達水平與E-cadherin表達呈負相關［12］；Si等［13］指出，ZEB2可通過與GATA3的循環反饋作用而抑制核轉錄，進一步誘導EMT的發生，促進乳腺癌轉移。本組乳腺癌中ZEB2蛋白及 mRNA表達均顯著高于乳腺良性病變，且乳腺癌中 ZEB2蛋白表達與 mRNA表達呈正相關，推測 ZEB2可能參與乳腺癌的發生、進展。隨著腫瘤直徑的增大、淋巴結轉移的發生和 TNM分期的增高，ZEB2蛋白陽性率均明顯增高；HER-2高表達者，ZEB2陽性率亦顯著增高，進一步證實ZEB2在乳腺癌進展中的推動作用。ZEB2高表達的乳腺癌患者OS及RFS均顯著降低，證實ZEB2表達與乳腺癌預后相關。

綜上所述，本組結果提示BCL-6和ZEB2是乳腺癌惡性演進過中的兩項重要因子，檢測 BCL-6、ZEB2表達有望成為監測與預警乳腺癌侵襲、轉移及預后的重要手段。此外，實驗發現乳腺癌組織中BCL-6與ZEB2蛋白表達、BCL-6與ZEB2 mRNA表達均呈正相關，提示 BCL-6與 ZEB2在乳腺癌的演進過程中可能具有某種相互促進作用，但具體機制尚有待進一步分析。

［1］ Yu JM，Sun W，Hua F，etal.BCL-6 induces EMT by promoting the ZEB1-mediated transcription repression of E-cadherin in breastcancer cells［J］.Cancer Lett，2015，365（2）：190－200.

［2］ Todorovic′M，Balint B，Andjelic B，et al.Switching to BCL-6 negativity in relapsed diffuse large B cell lymphoma correlated with more aggressive disease course［J］.Indian JHematol Blood Transfus，2014，30（4）：269－274.

［3］ 陶 琨，朱雄增，徐薇苓，等.原癌基因bcl-6在淋巴組織增生性疾病中表達及意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2000，16 （2）：93－95.

［4］ Wu Q，Liu X，Yan H，et al.B-cell lymphoma 6 protein stimulates oncogenicity of human breast cancer cells［J］.BMCCancer，2014，14（1）：418－429.

［5］ Walker SR，Liu S，Xiang M，etal.The transcriptionalmodulator BCL6 as amolecular target for breast cancer therapy［J］.Oncogene，2015，34（9）：1073－1082.

［6］ Logarajah S，Hunter P，Kraman M，et al.BCL-6 is expressed in breast cancer and preventsmammary epithelial differentiation［J］. Oncogene，2003，22（36）：5572－5578.

［7］ Bos R，Van Diest P J，Van der Groep P，etal.Protein expression of B-cell lymphoma gene 6（BCL-6）in invasive breast cancer is associated with cyclin D1 and hypoxia-inducible factor-1alpha （HIF-1alpha）［J］.Oncogene，2003，22（55）：8948－8951.

［8］ Pinto A E，AndréS，Silva G，et al.BCL-6 oncoprotein in breast cancer：loss of expression in disease progression［J］.Pathobiology，2009，76（5）：235－242.

［9］ Voutsadakis I A.Epithelial-mesenchymal transition（EMT）and regulation of EMT factors by steroid nuclear receptors in breast cancer：a review and in silico investigation［J］.J Clin Med，2016，5（1）：11－33.

［10］Katoh M.Integrative genomic analyses of ZEB2：Transcriptional regulation of ZEB2 based on SMADs，ETS1，HIF1alpha，POU／OCT，and NF-kappaB［J］.Int JOncol，2009，34（6）：1737－1742.

［11］毛苡澤，王世宣.ZEB家族與腫瘤［J］.國際病理科學與臨床雜志，2011，31（4）：333－337.

［12］Lee JY，Park M K，Park JH，etal.Loss of the polycomb protein Mel-18 enhances the epithelial-mesenchymal transition by ZEB1 and ZEB2 expression through the downregulation of miR-205 in breast cancer［J］.Oncogene，2014，33（10）：1325－1335.

［13］SiW，Huang W，Zheng Y，et al.Dysfunction of the reciprocal feedback loop between GATA3-and ZEB2-nucleated repression programs contributes to breast cancermetastasis［J］.Cancer Cell，2015，27（6）：822－836.

Expression and significance of BCL-6 and ZEB2 in breast cancer

ZHENG Li1，ZHAO Min1，ANG Lin1，HUANG Jin1，WANG Jin1，ZOU Qiang1，WU Zheng-sheng2
（1Department of Pathology，the Second People’s Hospital of Hefei，Hefei 230011，China；2Department of Pathology，AnhuiMedical University，Hefei 230032，China）

PurposeTo explore the biological significance of BCL-6 and ZEB2 in invasion，metastasis and prognosis of breast cancer.M ethodsThe expressions of BCL-6，ZEB2 protein andmRNA were detected respectively in 228 cases of breast cancer and 80 cases of breast benign lesions by immunohistochemical SP two-step staining and situ hybridization.ResultThe expression levels of BCL-6，ZEB2 protein and mRNA in breast cancer tissueswere significantly higher than in breast benign lesions（P＜0.05）.The expressions of BCL-6 was positively correlated with tumor size，lymphaticmetastasis，histological grade，TNM staging and HER-2 expression（P＜0.05）. The expressions of ZEB2 was positively correlated with tumor size，lymphatic metastasis，TNM staging and HER-2 expression （P＜0.05）.The overall survival and relapse-free survival of BCL-6 and ZEB2 positive expression were significantly less than the negative expression（P＜0.01）.ConclusionThe BCL-6 and ZEB2 are closely correlated with the evolution process of breast cancer，which may become importantmeans for monitoring and warning the metastasis，invasion，and prognosis of breast cancer.

breast neoplasm；BCL-6；ZEB2；immunohistochemisty；situ hybridization

R 737.9

A

1001－7399（2017）01－0050－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.013

接受日期：2016－11－21

合肥市自主創新政策“借轉補”項目［合科（2014）71號］

1合肥市第二人民醫院病理科，合肥 230011

2安徽醫科大學病理學教研室，合肥 230032

鄭 麗，女，碩士研究生，醫師。E-mail：zhengli352＠163. com

趙 敏，女，主任醫師，通訊作者。E-mail：zhao.min.hi＠163.com