外源NO緩解秋茄低溫脅迫傷害的生理機制研究

余敏　杜照奎　王麗佳　祝慶

摘要：為探討外源一氧化氮（NO）提高紅樹植物抗低溫的生理機制，以秋茄（Kandelia obovata）為試驗材料，對其施加不同濃度（0、0.1、0.5、1.0和1.5 mmol/L）的外源NO供體（SNP），并進行4 ℃低溫處理，研究外源NO對低溫脅迫下秋茄幼苗葉片的相對電導率、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性和滲透調節物質含量的影響。結果表明，SNP處理降低了秋茄幼苗葉片相對電導率和MDA含量，提高了葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性以及可溶性蛋白質、可溶性糖和游離脯氨酸的含量，從而降低了低溫脅迫對秋茄幼苗的傷害，以0.5 mmol/L SNP處理效果最佳。低溫脅迫下，適宜濃度的外源NO通過提高抗氧化酶活性，促進滲透調節物質的合成，降低膜透性和膜脂過氧化水平，保護了細胞膜結構的穩定性，從而提高秋茄幼苗抗低溫脅迫的能力。

關鍵詞：紅樹植物；秋茄（Kandelia obovata）；低溫；外源硝普鈉；抗氧化酶；滲透調節物質

中圖分類號：Q949.761.7；Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0490-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.024

Physiological Mechanism of Exogenous Nitric Oxide on Alleviating Low Temperature Stress of Kandelia obovata

YU Mina，DU Zhao-kuia，b，c，WANG Li-jiaa，ZHU Qinga

（a.School of Life Sciences； b.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Evolutionary Ecology and Conservation；c.Institute of Ecology， Taizhou University， Taizhou 318000， Zhejiang， China）

Abstract： Aiming to explore the physiological mechanism of exogenous NO donor sodium nitroprusside（SNP） improving the ability of low temperature endurance of mangrove，Kandelia obobata seedlings were chosen as experimental materials，different concentrations of sodium nitroprusside（SNP）（0，0.1，0.5，1.0 and 1.5 mmol/L） was employed as exogenous nitric oxide（NO） donor to study the effects of different concentrations of exogenous NO on the plant relative electrical conductivity，MDA content，the activities of antioxidative enzymes and the contents of osmotic adjustment substance of K. obovata seedlings under 4 ℃ low-temperature stress. The results showed that，the treatment of SNP could reduce the relative electrical conductivity and content of MDA； increase the activities of SOD，POD，CAT and APX， and the content soluble protein， soluble sugar and free praline of the seedlings under low-temperature stress to reduce the damage caused by chilling. It was also found that the cold resistance effect of treatment with 0.5 mmol/L SNP was the best. It indicated that the exogenous NO with proper concentration could enhance the K. obovata seedlings adaptability for low temperature stress through improving the activities of antioxidative enzymes， increasing the osmotic adjustment substance contents， to reduce membrane lipid peroxidation and protecting the stability of cell membrane structure.

Key words： mangrove； Kandelia obovata； low temperature； exogenous sodium nitroprusside； antioxidative enzyme； osmotic adjustment substance

紅樹林處于熱帶、亞熱帶海洋和陸地過渡區，是一種低緯度海岸帶地區特殊的濕地生態系統，具有調節環境氣候、維護生態的多樣性、防浪穩固海岸、抵抗自然災害、降解環境污染、為人類提供多樣的生物資源等多功能[1]。秋茄（Kandelia obovata）是紅樹科秋茄屬植物，也是在中國分布最廣泛的紅樹林種類[2]，多見于中國東南沿海地區，如海南、廣西、廣東、臺灣、福建和浙江等地。鑒于秋茄重要的生態功能和價值，人們一直致力于其向高緯度地區引種。秋茄雖是眾多紅樹植物中耐寒性最強的種類，但高緯度地區冬季極端低溫天氣會使得秋茄遭受到凍害，甚至引起植株的死亡。

NO是一種易溶于脂類和水分子的活性小分子氣體，在植物對生物和非生物脅迫反應、細胞程序性死亡、呼吸作用、光形態建成、果實成熟、葉片伸展、氣孔關閉、植物衰老、開花調控和激素反應等過程中起著重要的調節作用[3]。近年來研究表明，NO在提高植物的抗逆性反應中起著重要的作用，因而越來越受到大家的關注[4]，但有關外源NO在秋茄抗寒性方面的研究鮮見報道。現以秋茄盆栽幼苗為試材，研究低溫脅迫下外源不同濃度的NO供體——硝普鈉（SNP）對其葉片抗氧化系統及滲透調節物質的影響，闡明低溫脅迫時NO調控秋茄幼苗抗寒性的機理，旨在提高秋茄幼苗期的耐寒性，并為高緯度秋茄的栽培種植提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料培養和處理

試驗在浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室進行。2015年6月上旬，將采自浙江省玉環縣茅埏島的秋茄繁殖體——胚軸扦插至裝有海泥的塑料盆中，每盆1株，正常管理。2015年11月初，選取長勢整齊的幼苗，分成6組，每組5株，移入人工氣候室，光照度為9 000 lx，光/暗周期為14 h/10 h，溫度為28 ℃/15 ℃，相對濕度70%。室內適應3 d后，開始葉面噴施SNP，以藥液附于葉面全部濕潤但不下滴為度。

試驗設置6個處理：①CK1：28 ℃培養+噴施蒸餾水；②CK2：4 ℃培養+噴施蒸餾水；③T1：4 ℃處理+噴施0.1 mmol/L SNP；④T2：4 ℃處理+噴施0.5 mmol/L SNP；⑤T3：4 ℃處理+噴施1.0 mmol/L SNP；⑥4 ℃處理+噴施1.5 mmol/L SNP。每天上午9：00左右噴1次，連續處理3 d后采集幼苗每枝條的第2片葉片測定各項生理指標，每處理5次重復。

1.2 測定方法

采用電導率儀法[5]測定葉片相對電導率；采用硫代巴比妥酸法[5]測定丙二醛（MDA）含量；采用氮藍四唑法[6]測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈創木酚法[7]測定過氧化物酶（POD）活性；采用過氧化氫還原法[8]測定過氧化氫酶（CAT）活性；參照NaKano等[9]的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；采用考馬斯亮藍染色法[6]測定可溶性蛋白質的含量；采用蒽酮比色法[6]測定可溶性糖的含量；采用茚三酮顯色法[6]測定脯氨酸含量。各參數的含量均以鮮重計。

1.3 數據統計分析

采用Excel 2003對數據進行整理和繪圖，運用SPSS 13.0進行顯著性檢驗。文中數值為平均值±標準差（x±SD）。

2 結果與分析

2.1 外源NO對低溫脅迫下秋茄幼苗相對電導率的影響

逆境脅迫通常會引起植物細胞膜結構的破壞，導致細胞內電解質外滲，電導率增大，因此可以用電導率的相對變化來表示植物細胞的受損程度。由圖1可知，CK2的相對電導率顯著高于CK1，表明低溫導致秋茄葉片細胞的破損。而SNP處理的相對電導率均低于CK2，T1、T2、T3和T4分別較CK2降低了23.21%、33.93%、26.79%和26.78%，其中T2處理抑制相對電導率增加的效果最好。

2.2 外源NO對低溫脅迫下秋茄MDA含量的影響

MDA是細胞膜脂過氧化的產物，可以和細胞膜結構上的蛋白質和酶進行結合，從而破壞植物膜的結構，其含量越高意味著膜損傷程度越重。從圖2可知，CK2組MDA含量明顯高于CK1和SNP處理組，以T2處理的MDA含量最低，比CK2低40.30%，兩者差異顯著。說明低溫脅迫導致秋茄葉片細胞內過氧化產物MDA積累的增加，外源NO處理可抑制MDA的積累，在一定程度上緩解低溫對膜的傷害。

2.3 外源NO對低溫脅迫下秋茄幼苗抗氧化酶類活性的影響

SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶類在植物體內清除活性氧，保護植物免受氧化脅迫方面發揮著重要作用。由表1可知，CK2處理組SOD活性顯著低于CK1組，表明低溫處理顯著降低了秋茄葉片SOD活性；但經外源NO處理后，低溫脅迫下秋茄幼苗的SOD活性均比CK2有所提高，特別是T1和T2處理效果和CK2相比有顯著差異。溫度降低，秋茄葉片POD和CAT活性均增加，這可能是秋茄低溫適應的應對策略，外源NO處理后，兩者的增幅更大，T2處理的POD活性及T2處理的CAT活性較CK2分別增加37.86%和69.32%，均達到顯著水平。T1、T2和T3處理下，秋茄幼苗的APX活性分別較CK2高20.71%、36.90%、49.52%，但T4處理下APX活性較CK2降低2.47%，低溫下不同濃度的SNP對CAT和APX活性的影響有濃度效應，即低濃度促進，高濃度抑制，并且以T2和T3處理提高兩者活性的效果最好，與CK2相比有顯著性差異。數據分析表明，秋茄可以通過提高SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶的活性，清除低溫脅迫產生的氧自由基，從而達到保護細胞免受氧化脅迫的目的，以便更好地適應低溫環境。

2.4 外源NO對低溫脅迫下秋茄滲透調節物質的影響

可溶性蛋白質、可溶性糖和游離脯氨酸等均是植物細胞內重要的滲透調節物質，已有的研究表明，較多植物體內會累積滲透調節物質保護體內組織免受凍害。從表2可以看出，CK1組可溶性蛋白質含量顯著高于CK2組，表明低溫處理降低了秋茄葉片中可溶性蛋白質的量；但T1、T2、T3和T4組較CK2可溶性蛋白質的含量分別提高了66.56%、101.99%、87.42%和63.25%，且均顯著高于CK2，意味著外源NO可以有效提高秋茄葉片可溶性蛋白質的含量，其中T2甚至恢復到CK1的水平，效果最佳。CK2組較CK1組可溶性糖和脯氨酸含量顯著提高，增幅分別達到75.31%和33.41%。外源NO處理后，T1和T4較CK2組并沒有顯著提高可溶性糖和游離脯氨酸的含量，但T2和T3卻顯著提高了，表明外源NO對于提高該兩者的量具有濃度效應。以上數據表明外源NO處理可促進可溶性蛋白質、可溶性糖和游離脯氨酸等滲透調節物質在秋茄葉片中的積累，是提高秋茄低溫適應的另一重要因素。

3 小結與討論

植物遭受逆境脅迫后（如低溫、紫外線和重金屬等）細胞內產生大量活性氧自由基，引起膜脂質過氧化，蛋白質活性降低甚至喪失，細胞膜受損破裂，胞內電解質外流引起電導率增大，導致植物代謝紊亂[10]。因而，相對電導率和MDA含量是評價細胞膜透性和膜脂過氧化程度的重要指標[11]。已有研究結果表明，外源NO可抑制低溫脅迫下苦瓜幼苗葉片MDA含量的升高，降低葉片質膜相對透性，提高苦瓜低溫適應能力[12]；噴施外源NO供體SNP能顯著提高蝴蝶蘭抗低溫能力，質膜透性和MDA含量均顯著降低[13]；外源NO可以顯著降低低溫脅迫下核桃幼苗葉片的質膜相對透性及丙二醛含量，緩解其遭受的冷脅迫損傷[14]；本研究結果與前人研究結果大體相同，即低溫脅迫會對秋茄葉片細胞膜造成傷害，具體表現為MDA積累，電解質滲漏率增加。噴施外源NO供體SNP可明顯減輕秋茄葉片的電解質滲漏率和MDA含量上升的幅度，表明外源NO處理可在一定程度上提高秋茄對低溫脅迫的適應能力。

植物細胞中SOD、POD、CAT和APX等是其內源抗氧化酶系統的重要組成部分，能有效清除植物體內的氧自由基和過氧化物[15]，其活性水平在一定程度上代表了細胞清除活性氧自由基的能力，也間接反映了植物對逆境脅迫的適應能力[16]。本試驗結果表明，低溫脅迫處理使得秋茄葉片的POD、CAT和APX活性均呈上升趨勢，但與常溫對照相比，差異并不顯著，這可能是秋茄主動適應低溫的反應；而SOD活性則顯著下降，這可能是由于活性氧大量生成使細胞抗氧化酶系統明顯受到了抑制和破壞，脅迫強度超出秋茄植株的耐受能力，使得酶活下降。研究表明，低濃度NO不僅可作為抗氧化劑迅速清除活性氧自由基，而且能誘導抗氧化酶基因的表達，提高酶活性[17]。本研究中，SNP處理顯著提高了低溫脅迫下秋茄幼苗葉片SOD活性，有利于促進O2·-歧化生成H2O2，而H2O2主要通過POD、CAT和APX得以清除，減輕了活性氧自由基的破壞作用，提高了秋茄幼苗對寒冷的適應性。

植物細胞內重要的滲透調節物質包括可溶性蛋白質、可溶性糖和游離脯氨酸等[18]。前人研究表明，很多植物在低溫脅迫下會累積可溶性蛋白質、可溶性糖和游離脯氨酸等滲透調節物質以適應寒冷，保護體內組織免受凍害[18，19]。本研究中，低溫脅迫條件下，CK2較CK1組可溶性蛋白質含量顯著降低，這可能是低溫脅迫的被動反應，但可溶性糖和游離脯氨酸含量卻顯著上升，可能是秋茄應對低溫的適應策略；當外源NO處理低溫下的秋茄后，無論是可溶性蛋白質、可溶性糖還是游離脯氨酸含量均較CK2顯著上升。張玲玲等[20]用外源NO對處理NaCl脅迫下的秋茄幼苗，發現表明SNP處理促進葉片中脯氨酸含量的上升，使秋茄更好地適應鹽生環境，這與本研究結果類似。據此認為外源NO供體SNP處理能夠提升低溫脅迫條件下秋茄葉片內的滲透調節物質含量，從而進一步提高其葉片細胞滲透調節能力，更有利于秋茄在低溫脅迫下維持細胞的結構和功能。

綜上所述，外源NO可以提高秋茄幼苗葉片SOD、POD、CAT和APX等4種抗氧化酶的活性，清除低溫脅迫產生的氧自由基，降低相對電導率和MDA含量，保護秋茄幼苗的細胞膜系統；同時增加可溶性蛋白質、可溶性糖和游離脯氨酸等滲透調節物質的含量，維持細胞正常代謝，從而增強了秋茄幼苗對低溫脅迫的適應性。本試驗是在室內模擬完成的，冬季灘涂上生長的秋茄可能會受到水淹和鹽脅迫，甚至于更低溫度和更長時間的脅迫，環境更為惡劣，研究結果能否在野外條件下發揮作用有待于進一步探討。

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