12份白花泡桐材料親緣關系的ISSR分析

鄭興華++鄭正練++丁慧++肖少華++覃子海

摘 要 以‘福桐、‘綠桐2個無性系與10個不同種源的白花泡桐個體為研究對象，采用ISSR分子標記對12份白花泡桐材料的親緣關系進行研究，并利用DPSv3.01進行聚類分析。結果表明：10條引物共擴增出66條條帶，其中有37條多態帶，多態性比例為56.1%。根據ISSR聚類分析結果，在遺傳距離為0.35時，12份白花泡桐材料可分為5類，第1類為‘福桐無性系與河南、河北種源個體；第2類為‘綠桐無性系與湖南、湖北、江蘇種源個體；第3類為浙江、廣東種源個體；第4類為江西、福建種源個體；第5類為廣西種源個體。此結果可確定‘福桐與‘綠桐為2個不同的無性系。

關鍵詞 白花泡桐 ；親緣關系 ；簡單重復序列區間擴增多態性（ISSR）

中圖分類號 S792.43 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.009

ISSR Analysis of Relationship of 12 Accessions of Paulownia fortunei

ZHENG Xinghua ZHENG Zhenglian DING Hui XIAO Shaohua QIN Zihai

（Guangxi Futong Forestry Science and Technology Co.， Ltd.， Nanning， Guangxi 530021）

Abstract The genetic relationship of 12 accessions of Paulownia fortunei including two clones‘Fu Tong， ‘Lv Tong clones and 10 individuals of different provenances was analyzed by ISSR data and clustered with DPSv3.01. The results showed that a total of 66 DNA bands were obtained， of which 37 bands were polymorphic and the percentage of polymorphic bands was 0.561. All these accessions could be divided into five groups by ISSR cluster analysis. The first group consisted of clone ‘Fu Tong and individuals of Henan and Hebei provenances； the second group included clone ‘Lv Tong and the individuals of Hunan， Hubei and Jiangsu provenances； the third group the individuals of Zhejiang and Guangdong provenances； the fourth group the individuals of Jiangxi and Fujian provenances； and the fifth group the individuals of Guangdong provenances. It is hence concluded that clones‘Fu Tong and ‘Lv Tong are different.

Keywords Paulownia fortunei ； genetic relationship ； inter-simple sequence repeat

泡桐（Paulownia）為中國最重要的速生優質用材和生態防護樹種之一，在中國林業生產和生態環境保護方面一直發揮著不可替代的作用。中國泡桐種質資源分布廣泛，種類豐富，僅大陸就有9種2變種和眾多變異類型[1]。白花泡桐（Paulownia fortunei）為玄參科（Scrophulariaceae）泡桐屬落葉喬木，高達20 m，在中國分布于10多個?。▍^）。具有耐鹽堿、抗性強、對氣候適應范圍廣、生長快、材質優異、生態價值高等特點，為中國中東部地區的重要速生造林樹種[2]，具有很大的發展潛力。

為開發利用泡桐資源，國家林業局專門成立了泡桐研究開發中心，收集泡桐優良種質資源，選育泡桐優良無性系，在林分結構、經營密度、干形培育等定向培育方面取得了較大進展。同時以泡桐木材為基材，研發磁控濺射鍍膜木材技術，為泡桐木材的利用及增值奠定了基礎，有利于整個泡桐產業的提質增效。

除國家層面外，河南、江西、山東、貴州等省份也有泡桐研究及開發利用的相關報告。在廣西，目前主推的泡桐品種有‘福桐、‘綠桐等，但其來源地不甚清楚。為此，本研究開展研究摸清其來源，為其造林推廣提供參考信息。

ISSR（inter-simple sequence repeat）分子標記是由zietkiewiez等提出的一種新型分子標記，是在SSR（simple sequence repeat）標記基礎上發展起來的一種通過半隨機性引物進行PCR擴增的技術，可用于檢測重復序列之間區域的DNA序列差異[3]。ISSR標記結合了RAPD和SSR的優點，具有模板需要量少、多態性豐富、無需試劑盒、結果記錄方便、實驗成本低、操作簡單、實驗穩定性較高等優點[4]。自從發展ISSR標記以來，ISSR已在遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、種群遺傳學、種質資源、育種、種質評估、分類學與種系發生學等方面得到了迅速應用，是用于分析物種、種群、不同品系、個體間遺傳差異的理想方法，具有廣闊的應用前景[5-8]。

本研究將利用ISSR標記對‘福桐、‘綠桐無性系及10個種源的白花泡桐個體進行鑒定及親緣關系分析，以期為泡桐的資源利用、品種鑒定及知識產權保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

12份材料均為白花泡桐，采自廣西福桐林業科技有限公司種質資源收集圃。材料的來源地分別為：江西、浙江、河南、福建、廣東、湖北、湖南、江蘇、河北、廣西等10個?。▍^），每個省（區）采集1個個體，實驗的材料還包括綠桐公司的‘綠桐及廣西福桐林業科技有限公司的‘福桐2個無性系材料。供試材料見表1。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采集新鮮葉片，擦拭干凈后，置于自封袋內，放入硅膠干燥處理。稱取0.1 g左右的干葉，用Fastprep（Bio101，USA）粉碎，以CTAB法提取每個樣本的總DNA[9-10]。

1.2.2 ISSR-PCR反應體系與擴增程序

泡桐的ISSR反應體系為：在25 μL的PCR體系中，包括1×Taq酶緩沖液，1.25 U Taq DNA聚合酶（天根），4種dNTP各0.2 mmol/L，0.4 μmol/L引物，2.0 mmol/L MgCl2，50 ng模板DNA。最佳PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，52℃復性45 s，72℃延伸2 min，共38個循環；循環結束后72℃保存5 min，最后4℃保存[11]。試驗設3次重復。

PCR產物在2.0%瓊脂糖電泳，按照相同遷移位置上有擴增條帶記為“1”、無擴增條帶則記為“0”的方法記錄每個引物的電泳譜帶，將“0”、“1”數據輸入Excel表格中，采用UPGMA法，在DPSv3.01統計分析軟件中進行聚類分析[12-13]。

2 結果與分析

2.1 ISSR條帶和多態性分析

從60對引物中篩選出10條帶型清晰、多態性好的引物進行ISSR-PCR擴增，分別為：UBC807、UBC808、UBC809、UBC817、UBC825、UBC828、UBC830、UBC836、UBC846、UBC856。結果顯示：10條引物共擴增到66條不同的DNA條帶，其中多態性條帶有37條，多態性比例為56.1%；每條引物擴增出的ISSR多態性條帶在4～12間，平均每條引物能擴增出3.7條多態性條帶；擴增片段大小在100～2 000 bp。引物UBC807、UBC830的電泳結果見圖1。

2.2 12份白花泡桐ISSR聚類分析

按Nei和Li（1979）的方法計算遺傳距離。結果表明，‘福桐無性系和河北種源的個體之間的遺傳距離最近，二者的遺傳距離為0.12。福建種源個體與‘福桐無性系的遺傳距離最遠，它們之間的遺傳距離為0.739。‘綠桐無性系與湖南種源的個體之間的遺傳距離最近（遺傳距離為0.131），與江西種源的個體之間的遺傳距離最遠（遺傳距離為0.565）?！G桐與湖南、湖北、江蘇種源的個體聚為一支，‘福桐與河南、河北種源的個體聚為一支。在遺傳距離為0.35時，12份白花泡桐材料可分為5類，第1類為‘福桐無性系與河南、河北種源個體；第2類為‘綠桐無性系與湖南、湖北、江蘇種源個體；第3類為浙江、廣東種源個體；第4類為江西、福建種源個體；第5類為廣西種源個體（圖2）。

3 討論

本研究中的試驗材料有10個種源分別來自10個不同的省（區），另有2個未知來源地的無性系材料‘福桐和‘綠桐。結果表明，地理位置相近的種源個體之間的遺傳距離也相近，如湖南與湖北、河南與河北、江西與福建、及江西與廣西等。但也有少數例外，如浙江與廣東種源個體之間的遺傳距離小于浙江與福建種源個體之間的遺傳距離，這可能由以下2個原因造成：一是每個種源的取樣數只有1個，造成的試驗或統計上的誤差，二是白花泡桐栽培歷史悠久，不同種源間的種苗存在相互調撥的情況。

‘福桐和‘綠桐無性系分別為廣西福桐林業科技有限公司和綠桐公司選育，近年來在廣西、廣東、福建、江西、貴州等省（區）大面積推廣。通過此研究，確定‘福桐及‘綠桐的來源地，有助于確定其最適宜的栽培及推廣區域。‘福桐和‘綠桐無性系間的遺傳距離為0.28，在遺傳距離為0.35時，‘福桐無性系與河南、河北種源個體聚為一支，‘綠桐無性系與湖南、湖北、江蘇種源的個體聚為另外一支。因此‘福桐和‘綠桐為不同的無性系，且來源地不同。

本研究結果為‘福桐和‘綠桐無性系的來源地提供了一定的信息，有利于指導其推廣種植。隨著白花泡桐扦插及組培技術的成熟[14-15]，白花泡桐的無性系造林得以實現，選用適宜的無性系進行無性系造林將會進一步提高白花泡桐林分的產量。

參考文獻

[1] 鄧建軍，李芳東，喬 杰，等. 白花泡桐優樹種質資源收集保存及繁殖技術研究[J]. 中南林業科技大學學報，2011，31（4）：50-55.

[2] 曲金柱，崔 波，馬 杰，等. 白花泡桐葉柄愈傷組織再生植株的誘導與培養[J]. 信陽師范學院學報（自然科學版），2006，19（4）：407-410.

[3] 胡紹慶，邱英雄，吳光洪，等. 桂花品種的ISSR-PCR分析[J]. 南京林業大學學報（自然科學版），2004，28（1）：71-75.

[4] 劉海龍，王以紅，陳博雯，等. 利用ISSR標記方法鑒定5個桉樹優良無性系[J]. 西部林業科學，2011，40（3）：66-68.

[5] 陳永忠，譚曉風，彭邵鋒，等. 應用ISSR分析油茶無性系的遺傳多樣性[J]. 東北林業大學學報，2008，36（6）：19-23，36.

[6] 吳幼媚，劉海龍，王以紅，等. 廣西種源紅錐栽培群體遺傳多樣性評價[J]. 安徽農業科學，2012，40（3）：1 435-1 436.

[7] 劉海龍，陳曉明，覃子海，等. 紅錐、白椎、大葉櫟3個樹種分子鑒定及親緣關系的ISSR分析[J]. 安徽農業科學，2011，39（30）：18 419-18

420，18 450.

[8] Zong M， Liu H L， Qiu Y X， et al. Genetic diversity and geographic differentiation in the threatened species Dysosma

pleiantha in China as revealed by ISSR analysis[J]. Biochem Genet， 2008， 46（1）： 180-196.

[9] 李軍集，廖和發，劉海龍. 藥用植物六角蓮基因組DNA提取方法[J]. 廣西林業科學，2007，36（2）：89-92.

[10] 覃子海，楊開太，藍 肖，等. 紅錐總DNA提取技術研究[J]. 廣西林業科學，2011，40（3）：54-55.

[11] 覃子海，黃金使，劉海龍，等. 桉樹的ISSR反應體系建立及優化[J]. 廣西林業科學，2007，36（4）：196-198，205.

[12] 唐啟義，馮明光. 實用統計分析及其DPS數據處理系統[M]. 北京：科學出版社，2002：185-260.

[13] 劉海龍，馬錦林，張日清，等. 11份山茶屬植物親緣關系的ISSR分析[J]. 經濟林研究，2012，30（4）：87-90.

[14] 江香梅，戴小英，溫 強，等. “桐優 1”等泡桐優良無性系組培高效繁育體系建立[J]. 江西林業科技，2009，37 （2）：11-14.

[15] 李峰卿，曾滿生，姚甲寶，等. 泡桐脫毒組培苗生產與容器育苗技術研究[J]. 現代農業科技，2010，22（1）：182-183，189.

① 收稿日期：2016-10-10；責任編輯/黃東杰；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 鄭興華（1969～），男，工程師，主要研究方向為林業產業開發，E-mail： 525073088@qq.com。

③ 通訊作者：覃子海（1980～），男，高級工程師，主要研究方向為林業生物技術應用，E-mail： 75455621@qq.com。