茯苓多糖對急性胰腺炎大鼠腸道屏障功能損傷和炎性反應(yīng)的作用

石振國，蘇錦，任永樂，白筱晞

(榆林市府谷縣人民醫(yī)院普通外科，陜西 榆林 719499)

茯苓多糖對急性胰腺炎大鼠腸道屏障功能損傷和炎性反應(yīng)的作用

石振國，蘇錦，任永樂，白筱晞

(榆林市府谷縣人民醫(yī)院普通外科，陜西 榆林 719499)

目的 探究茯苓多糖對急性胰腺炎(AP)大鼠腸道屏障功能損傷和炎性反應(yīng)的作用。方法將60只大鼠隨機分為假手術(shù)組、AP組、AP+低劑量茯苓多糖組、AP+中劑量茯苓多糖組和AP+高劑量茯苓多糖組，每組12只。AP組大鼠腹腔注射50 g/kg雨蛙素，給藥組在AP組大鼠造模前分別灌胃給予50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg茯苓多糖。模型構(gòu)建12 h后，檢測大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量；檢測大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度和病理學(xué)評分；RT-PCR檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，ELISA檢測TNF-α、白介素-1β(IL-1β)、IL-6水平；Western blot檢測JAK2和STAT3的表達(dá)。結(jié)果實驗發(fā)現(xiàn)，與AP組相比，AP+低劑量茯苓多糖組、AP+中劑量茯苓多糖組和AP+高劑量茯苓多糖組茯苓多糖均可顯著減少AP大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶含量；增加小腸黏膜厚度和絨毛高度，減少上皮損傷；降低TNF-α，IL-1β和IL-6水平；抑制JAK2，STAT3蛋白磷酸化；且以上作用均呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系。結(jié)論茯苓多糖可減輕AP大鼠腸道屏障功能損傷和炎性反應(yīng)，且可能與抑制JAK2/STAT3通路相關(guān)。

茯苓多糖；急性胰腺炎；腸道屏障功能；炎性反應(yīng)；JAK2/STAT3

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)作為臨床常見的急腹癥之一，其本質(zhì)是全身炎癥反應(yīng)綜合征[1]。目前急性胰腺炎的發(fā)病機制尚無定論，但多數(shù)與腸黏膜屏障破壞引起的細(xì)菌易位相關(guān)[2]，因此，加強腸道屏障功能的保護和抑制炎性反應(yīng)是急性胰腺炎治療的核心和關(guān)鍵[3]。茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]為多孔菌科臥菌屬真菌的干燥菌核，是一種常用的傳統(tǒng)中藥[4]。茯苓多糖(pachymaran)作為其主要有效成分，占茯苓干重的70%～90%，由線型β(1～3)-D-葡聚糖構(gòu)成[5]。早期研究表明，茯苓多糖具有顯著的增強免疫和抗腫瘤作用，近來被證實，茯苓多糖也具有一定的抗炎效果[6]。本文構(gòu)建AP大鼠模型，探究茯苓多糖對AP大鼠腸道屏障功能損傷和炎性反應(yīng)的影響及可能的作用機制，為其在臨床上治療AP提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只，6～8周，體質(zhì)量(200±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑 茯苓多糖購于寧波德康生物制品有限公司；雨蛙素購于美國Sigma公司；血清淀粉酶、脂肪酶試劑盒購于南京建成有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)和IL-6試劑盒購于江蘇晶美生物科技公司；RNA提取和PCR擴增試劑盒購于日本Takara公司；所用抗體均購于英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備 將60只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、AP組、AP+低劑量茯苓多糖組、AP+中劑量茯苓多糖組、AP+高劑量茯苓多糖組，每組12只。實驗前給予動物充足的飼料和水，12 h燈光/12 h黑暗環(huán)境下適應(yīng)一周。假手術(shù)組大鼠開腹后僅翻動腸管和膽胰管，不做其他處理。大鼠進行誘導(dǎo)前12 h禁食水。AP組大鼠腹腔注射50 g/kg雨蛙素，連續(xù)7次，每次間隔1 h。給藥組即在AP組大鼠造模前連續(xù)兩周分別灌胃給予50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg茯苓多糖。各組大鼠在處理完成后12 h分別取材。

1.2.2 檢測大鼠的腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶 10%水合氯醛麻醉各組大鼠，打開胸腔和腹腔，用干棉球吸附大鼠腹水，電子天平分別記錄干棉球重量(干重，mg)及汲取腹水之后的重量(濕重，mg)，計算腹水量(mg)=濕重-干重。收集大鼠腹部主動脈血液，待血液凝固后離心獲得血清樣本。分別用血清淀粉酶試劑盒和脂肪酶試劑盒檢測血清淀粉酶和脂肪酶含量。

1.2.3 檢測大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度和上皮損傷指數(shù) 取大鼠距幽門10 cm處小腸，甲醛固定后進行光鏡檢查，測定小腸絨毛高度及黏膜厚度，并且進行病理學(xué)評分。

1.2.4 RT-PCR檢測TNF-α水平 取胰腺組織總RNA，采用RT-PCR試劑盒檢測A水平，TNF-α的引物序列為：上游：5'-CCTGCTGACGGGTTTACCT-3'，下游：5'-ATGGCAGACAGGATGTTGACC-3'，擴增產(chǎn)物長度為159 bp。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平 采用ELISA試劑盒檢測血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.2.6 Western blot檢測JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化水平 提取胰腺組織蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，進行SDS-PAGE凝膠電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗為鼠抗人的JAK2，p-JAK2、STAT3和p-STAT3(稀釋比例均為1:1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次。加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1:10 000)37℃孵育45 min，TBST洗滌3次，利用ECL液顯影檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計量數(shù)據(jù)間比較采用ANOVA分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茯苓多糖對AP大鼠腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶的影響 與假手術(shù)組相比，AP組大鼠腹水量、淀粉酶、脂肪酶顯著增多(P＜0.01)。與AP組相比，給予不同劑量茯苓多糖AP組大鼠的腹水量、淀粉酶、脂肪酶呈現(xiàn)劑量依賴性下調(diào)，給予高劑量茯苓多糖AP組的下調(diào)效果最顯著(P＜0.01)，見表1。

2.2 茯苓多糖對AP大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度以及上皮損傷指數(shù)的影響 與假手術(shù)組相比，AP組大鼠小腸黏膜厚度和絨毛高度顯著降低，上皮損傷指數(shù)顯著升高(P＜0.01)。與AP組相比，給予不同劑量茯苓多糖AP組大鼠的小腸黏膜厚度和絨毛高度顯著升高，上皮損傷指數(shù)顯著降低，其作用呈明顯的量效關(guān)系(P＜0.01)，見表2。

表1 茯苓多糖對AP大鼠腹水量、淀粉酶和脂肪酶的影響(±s)

表1 茯苓多糖對AP大鼠腹水量、淀粉酶和脂肪酶的影響(±s)

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與AP組比較，bP＜0.01。

組別假手術(shù)組(n=12) AP組(n=12) AP+低劑量茯苓多糖組(n=12) AP+中劑量茯苓多糖組(n=12) AP+高劑量茯苓多糖組(n=12) F值P值脂肪酶(U/L) 6072.45±550.24 12341.52±402.56a11036.23±321.09 9566.41±259.45ab8070.70±408.52ab28.78 0.00腹水量(mL) 0.90±0.53 2.36±0.55a2.10±0.88 1.75±0.53ab1.44±0.62ab13.74 0.00淀粉酶(U/L) 2241.20±109.45 6852.40±335.78a5969.45±268.47 4772.13±440.21ab3407.40±288.42ab687 0.00

表2 茯苓多糖對AP大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度以及上皮損傷指數(shù)的影響(±s)

表2 茯苓多糖對AP大鼠小腸黏膜厚度、絨毛高度以及上皮損傷指數(shù)的影響(±s)

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與AP組比較，bP＜0.01。

組別假手術(shù)組(n=12) AP組(n=12) AP+低劑量茯苓多糖組(n=12) AP+中劑量茯苓多糖組(n=12) AP+高劑量茯苓多糖組(n=12) F值P值小腸黏膜厚度(μm) 687.16±20.66 385.44±20.72a400.12±21.17 432.72±20.60ab510.62±21.52ab25.78 0.00絨毛高度(μm) 447.32±24.16 185.42±24.33a227.45±26.73 259.43±27.70ab333.50±24.15ab19.48 0.00上皮損傷指數(shù)0.75±0.14 5.53±0.22a4.90±0.17 3.86±0.19ab2.85±0.17ab78.51 0.00

2.3 茯苓多糖對AP大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的影響 與假手術(shù)組比較，AP組大鼠胰腺組織TNF-α mRNA水平和血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(P＜0.01)。與AP組比較，給予不同劑量茯苓多糖AP組大鼠胰腺組織TNF-α mRNA水平和血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均劑量依賴性顯著降低，給予高劑量茯苓多糖AP組的下調(diào)效果最顯著(P＜0.01)，見表3。

表3 茯苓多糖對AP大鼠炎性反應(yīng)指標(biāo)的影響(±s)

表3 茯苓多糖對AP大鼠炎性反應(yīng)指標(biāo)的影響(±s)

注：a與假手術(shù)組比較，P＜0.01；b與AP組相比較，P＜0.01。

組別假手術(shù)組(n=12) AP組(n=12) AP+低劑量茯苓多糖組(n=12) AP+中劑量茯苓多糖組(n=12) AP+高劑量茯苓多糖組(n=12) F值P值血清IL-6(pg/mL) 155.22±17.03 467.24±10.85a420.52±11.44 382.77±10.77ab310.56±16.27ab48.48 0.00 TNF-α(mRNA) 0.57±0.16 2.68±0.32a2.44±0.17 2.13±0.23ab1.49±0.14ab46.84 0.00血清TNF-α(pg/mL) 67.32±20.16 285.42±27.33a250.77±26.62 207.43±23.35ab145.72±20.26ab38.24 0.00血清IL-1β(pg/mL) 99.32±18.56 264.45±19.69a210.43±20.08 182.77±22.42ab166.22±21.11ab13.56 0.00

2.4 茯苓多糖對AP大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響 與假手術(shù)組比較，AP組大鼠胰腺組織JAK2和STAT3磷酸化水平均顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與AP組比較，給予不同劑量茯苓多糖AP組大鼠JAK2和STAT3磷酸化水平均劑量依賴性顯著降低，給予高劑量茯苓多糖AP組的抑制效果最顯著，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1和表4。

圖1 茯苓多糖對AP大鼠JAK2/STAT3信號通路蛋白的影響

表4 茯苓多糖對AP大鼠JAK2/STAT3信號通路蛋白磷酸化水平的影響(±s)

表4 茯苓多糖對AP大鼠JAK2/STAT3信號通路蛋白磷酸化水平的影響(±s)

注：a與假手術(shù)組相比較，P＜0.01；b與AP組比較，P＜0.01。

p-STAT3 0.43±0.13 1.24±0.27a1.17±0.28 1.03±0.28ab0.82±0.15ab19.49 0.00組別假手術(shù)組(n=12) AP組(n=12) AP+低劑量茯苓多糖組(n=12) AP+中劑量茯苓多糖組(n=12) AP+高劑量茯苓多糖組(n=12) F值P值p-JAK2 0.55±0.07 1.74±0.13a1.49±0.13 1.23±0.16ab1.06±0.27ab17.26 0.00

3 討 論

AP的病理生理過程復(fù)雜，具有發(fā)病急、并發(fā)癥多、預(yù)后差的特點，尤其是并發(fā)細(xì)菌感染后死亡率較高[3]。因此，尋找新型有效的藥物對臨床AP的治療具有重要意義。在桃仁提取物、姜黃素、細(xì)菌脂多糖等對AP的診斷研究中，腹水量、血清淀粉酶和脂肪酶等常用檢測指標(biāo)均明顯降低[3，7-8]。本文研究表明，茯苓多糖均可劑量依賴性減少AP大鼠腹水量，降低血清淀粉酶和脂肪酶，高劑量的茯苓多糖作用效果最顯著，初步確定了茯苓多糖對緩解大鼠AP具有一定的作用。AP患者腸道黏膜缺血、缺氧可以導(dǎo)致腸黏膜上皮損傷，腸通透性增加，而當(dāng)腸黏膜通道增高到一定程度時，細(xì)菌和內(nèi)毒素可穿過腸黏膜進入組織，導(dǎo)致腸源性感染，甚至誘發(fā)敗血癥和器官多功能障礙綜合征[3,9-10]。因此，腸黏膜屏障高通透性導(dǎo)致的腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的易位是AP高致死率的主要原因，而維持AP患者腸道黏膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定顯得尤為重要[3,11-12]。已有研究證實，中藥柴芍承氣湯可有效增加重癥胰腺炎(SAP)的腸絨毛高度和黏膜厚度，在SAP早期使用可對腸黏膜屏障起到保護作用[13]。生長抑素和大黃附子湯也可通過增加長絨毛高度和黏膜厚度減輕壞死性胰腺炎(ANP)對大鼠腸道屏障的損傷[14-15]。本文研究表明，茯苓多糖均可劑量依賴性增加AP大鼠小腸黏膜厚度和絨毛高度，降低上皮損傷指數(shù)，且高劑量的茯苓多糖作用效果最顯著，此結(jié)果證實了茯苓多糖可有效緩解AP大鼠腸道屏障損傷。

AP發(fā)病機制復(fù)雜，除腸道屏障損傷外，炎癥介質(zhì)的大量釋放是其病理生理過程發(fā)展的關(guān)鍵因素[16]。而炎性因子的釋放與腸道屏障損傷也有密切聯(lián)系。AP患者的胰腺局部炎癥可觸發(fā)并激活炎癥細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì)和促炎因子，包括TNF-α，IL-1β和IL-6等，而這些促炎癥細(xì)胞因子反過來進一步激活炎癥細(xì)胞，從而引起正反饋式的“炎癥級聯(lián)瀑布反應(yīng)”，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，且進一步加重腸黏膜屏障損傷[17]。在AP早期，血必凈可降低大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6濃度，被認(rèn)為是其治療AP可能的作用機制之一[1]。本文研究表明，茯苓多糖可劑量依賴性減少AP大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，緩解AP級聯(lián)反應(yīng)中的炎癥反應(yīng)程度，降低局部胰腺組織損傷，有助于AP的早期恢復(fù)。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)通路與AP的發(fā)生發(fā)展密不可分[18-19]。TNF-α、IL-1β和IL-6是通過活化JAK2/ STAT3通路進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，從炎性層面加重胰腺的病理損傷[20]。又發(fā)現(xiàn)在AP中，高遷移率蛋白B1(HMGB1)能增加大鼠胰腺腺泡細(xì)胞JAK2，STAT3，TNF-α和IL-1的mRNA和蛋白表達(dá)，提示HMGB1可能是通過誘導(dǎo)JAK/STAT通路活化來加重AP[18]。本研究表明，茯苓多糖均可劑量依賴性抑制AP大鼠JAK2和STAT3的磷酸化，高劑量茯苓多糖抑制效果尤為顯著，此結(jié)果提示，茯苓多糖可能通過抑制JAK2/STAT3通路緩解AP大鼠腸道屏障和炎性反應(yīng)等病理損傷。

本研究證實了茯苓多糖可減小AP大鼠腸道黏膜屏障損傷和炎性反應(yīng)，且其機制可能與抑制JAK2/ STAT3通路相關(guān)，對茯苓多糖的研究開發(fā)具有重大意義，并開拓了AP治療的新思路。

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Effects of pachymaran on intestinal barrier function damage and inflammation in rats with acute pancreatitis.

SHI Zhen-guo,SU Jin,REN Yong-le,BAI Xiao-xi.Department of General Surgery,Fugu People's Hospital,Yulin 719499, Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of pachymaran on intestinal barrier function damage and inflammation in rats with acute pancreatitis.MethodsSixty rats were randomly divided into 5 groups including the sham group,AP group,low-dose pachymaran group,medium-dose pachymaran group and high-dose pachymaran group,with twelve rats in each group.AP group rats received intraperitoneal injection of 50 mg/kg cerulein.The low-dose,medium-dose and high-dose pachymaran group were given intragastric administration of 50 mg/kg,100 mg/kg and 200 mg/kg pachymaran respectively before model construction of AP group.After twelve hours,the contents of the ascitic fluid,amylase and lipase were detected in rats with AP.The small intestinal mucosal thickness,villus height and epithelial damage index were detected in rats with AP.The levels of tumor necrosis factor α(TNF-α)were determined by RT-PCR, and the TNF-α,interleukins-1β(IL-1β)and IL-6 levels were determined by ELISA.The expressions of JAK2 and STAT3 proteins were determined by western blot.ResultsCompared to the AP group,different doses of pachymaran (low-dose,medium-dose and high-dose pachymaran group)reduced the contents of ascitic fluid,amylase and lipase,elevated the small intestinal mucosal thickness and villus height,reduced the epithelial damage index,decreased the levels of TNF-α,IL-1β and IL-6,and inhibited the expression of p-JAK2 and p-STAT3,all in a dose-dependent manner(P＜0.01).ConclusionPachymaran ameliorates the intestinal barrier function damage and inflammation in rats with AP, which may be associated with the inhibition of JAK2/STAT3 pathway.

Pachymaran;Acute pancreatitis;Intestinal barrier function;Inflammation;JAK2/STAT3

R-332

A

1003—6350（2017）03—0356—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.004

2016-06-30)

石振國。E-mail：lijieyulin@163.com