HPLC法同時測定制首烏無糖顆粒中大黃素、大黃素甲醚的含量

陳程，張存勞，羅國平，陳奇

(西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021)

HPLC法同時測定制首烏無糖顆粒中大黃素、大黃素甲醚的含量

陳程，張存勞，羅國平，陳奇

(西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021)

目的 建立制首烏無糖顆粒中大黃素、大黃素甲醚的含量測定方法。方法采用Agilent 5TC-C18 (150×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為甲醇-0.1%磷酸(80:20)，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫25℃。結果大黃素和大黃素甲醚分別在0.08～0.8 μg(r1=0.999 8)、0.04～0.4 μg(r2=0.999 7)范圍內與峰面積呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為100.04%、99.58%，RSD分別為0.77%，0.71%。3批樣品中大黃素的含量分別為0.159 mg/g、0.161 mg/g、0.170 mg/g，大黃素甲醚的含量分別為0.055 mg/g、0.064 mg/g、0.072 mg/g。結論本方法準確、專屬性好、重復性好，可作為制首烏無糖顆粒質量控制方法之一。

HPLC；制首烏無糖顆粒；大黃素；大黃素甲醚

制首烏為何首烏(Polygonum muhiflorum Thunb)的炮制加工品，具有補益精血、固腎烏須的功效[1]。現代藥理研究表明制首烏中二苯乙烯苷類化合物具有提高免疫力、抗衰老、防治動脈硬化及保肝等作用，臨床上主要用于防止高血壓病、高血脂病等，效果良好[2]。為了適應糖尿病、高血壓等的患者使用特點，前期研制了制首烏無糖顆粒，并結合主要藥效成分二苯乙烯苷初步建立了質量標準。但是研究表明制首烏及復方制劑在臨床應用中可能導致肝損傷，蒽醌類成分可能是致肝損傷的物質基礎，制首烏中蒽醌類主要成分為大黃素及大黃素甲醚[3]。因此為進一步全面評價制首烏無糖顆粒的質量，本文建立制首烏無糖顆粒中大黃素、大黃素甲醚的含量測定方法，為其質量評價提供新的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；SQP型分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精密實驗設備有限公司)；恒溫水浴鍋(北京市光明醫療儀器廠)。

1.2 材料 制首烏飲片(購于西安中藥飲片有限公司，生產批號120208，經薄層鑒別，符合《中國藥典》2015版一部規定)；制首烏無糖顆粒(實驗室自制，批號分別為20160302、20160303、20160304)；大黃素標準品(上海土蜂生物科技有限公司，批號：15041713)；大黃素甲醚標準品(上海土蜂生物科技有限公司，批號：15031127)；色譜甲醇(天津科密歐化學試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 取大黃素、大黃素甲醚適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含大黃素80 μg、大黃素甲醚40 μg的溶液，即得對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密稱定制首烏無糖速溶顆粒4.0 g，置于圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL并迅速稱定，加熱回流提取60 min，取出放冷，再次迅速精密稱定，用甲醇補足重量，搖勻，用濾紙過濾，取續濾液經0.22 μm微孔濾膜過，即得。

2.1.3 陰性對照溶液 按照處方量和制備工藝制成缺制首烏的樣品，并按“2.1.2”項下方法制得陰性對照溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent 5TC-C18 (150×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸(80：20)；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL。

2.3 系統適用性 分別取“2.1”項下3種溶液并按“2.2”項下色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結果表明，供試品溶液大黃素、大黃素甲醚與雜質峰之間得到很好地分離，陰性對照對測定無干擾，表明本方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 精密量取對照品溶液1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL，分別按“2.2”項下色譜條件進行進樣分析。以進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，分別繪制標準曲線并進行回歸計算。回歸方程分別為：Y1=2743.6X1+1.0410，r1=0.9998；Y2=1653X2-1.4738，r2=0.999 7。結果表明大黃素、大黃素甲醚分別在0.08～0.8μg、0.04～0.4μg范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 將對照品溶液重復進樣5次，結果大黃素、大黃素甲醚峰面積RSD分別為0.58%、1.19%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取制首烏無糖顆粒(20160302)按“2.1.2”和“2.2”項下方法制備供試品6份，分別進樣測定。結果大黃素、大黃素甲醚的平均含量分別為0.145 mg/g、0.057 mg/g；峰面積RSD分別為1.58%、1.39%，表明本方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取制首烏無糖顆粒(20160302)的供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12、24 h進樣測定。大黃素、大黃素甲醚峰面積RSD分別為1.74%、1.50%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的樣品(20160302)6份，每份2.0 g，加入對照品溶液適量，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液并按照“2.2”項下色譜條件進樣測得含量，進而計算加樣回收率，見表1。結果表明大黃素加平均樣回收率為100.04%、RSD為0.77%，大黃素甲醚平均加樣回收率為99.58%、RSD為0.71%，表明本方法準確性良好。

2.9 樣品含量測定 取3批制首烏無糖顆粒樣品，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行3份，按“2.2”項下色譜條件進行測定，按照外標法計算3批樣品中大黃素和大黃素甲醚的含量，見表2。

表1 加樣回收率試驗結果

表2 3批樣品中大黃素、大黃素甲醚含量測定結果(mg/g)

3 討 論

3.1 提取溶劑、方法的選擇 根據蒽醌類成分的理化性質，分別對提取方式(超聲、回流法)、提取溶劑(甲醇、無水乙醇)、提取時間進行考察，結果當提取條件為：50 mL甲醇回流提取1 h時大黃素和大黃素甲醚的峰面積最大，故選擇50 mL甲醇回流提取1 h。

3.2 流動相的選擇 為了保證指標成分分離良好，參考2015年版《中國藥典》(一部)中“制首烏”檢查項目，考察不同體積比的甲醇-0.1%磷酸分離效果，結果表明流動相比例為甲醇-0.1%磷酸(80:20)時峰形良好，分離效果良好，陰性無干擾。

3.3 小結 現代研究表明二苯乙烯苷類化合物是制首烏提高免疫力、抗衰老等作用的藥效物質基礎，蒽醌類成分可能是制首烏致肝損傷的物質基礎[4]。前期已經針對二苯乙烯苷建立質量標準，為了較為全面地控制該制劑的質量，本文建立制首烏無糖顆粒中兩種主要蒽醌類成分的含量測定方法，為該制劑的質量評價提供新的參考。

[1] 雷載權.中藥學[M].上海:上海科學技術出版社,1995:303.

[2]吳曉青.何首烏化學成分與藥理活性的研究進展[J].時珍國醫國藥,2009,20(1):146-147.

[3] 魏宇峰,周國兒.人參首烏膠囊制備工藝的研究[J].中國生化藥物雜志,2014,34(3):169-171.

[4]劉治軍,李林,葉翠飛,等.二苯乙烯苷對腦缺血嚙齒動物腦NMDA受體及細胞內鈣離子的影響[J].中國藥理學通報,2003,19(10): 1112-1115.

Simultaneous determination of emodin and physcion in sugar-free granules of Radix Polygoni Multiflori (Heshouwu)by HPLC.

CHEN Cheng,ZHANG Cun-lao,LUO Guo-ping,CHEN Qi.College of Pharmacy,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo establish the method for determination of emodin and physcion in sugar-free granules of Radix Polygoni Multiflori(zhishouwu).MethodsThe high performance liquid chromatography(HPLC)analysis was performed on a Agilent 5TC-C18(150×4.6 mm,5 μm)with methanol-0.1%phosphoric acd solution(80:20)as the mobile phase:flow rate:1.0 mL/min;column temperature:25℃;detection wavelength:UV 254 nm.ResultsThe emodin and physcion respectively showed the good linear relationship with peak area within the range of 0.08-0.8 μg (r1=0.9998)and 0.04-0.4 μg(r2=0.9997).The average recoveries of samples were 100.04%and 99.58%,respectively, with the relative standard deviation(RSD)of 0.77%and 0.71%,respectively.The content of emodin in three samples were 0.159 mg/g,0.161 mg/g and 0.170 mg/g,and the content of physcion in three samples were 0.055 mg/g,0.064 mg/g and 0.072 mg/g.ConclusionThe method is accurate,with good specificity and good reproducibility,and can be used as one of the quality control methods for the sugar-free granules of Radix Polygoni Multiflori.

High performance liquid chromatography(HPLC);Sugar-free granules of Radix Polygoni Multiflori;Emodin;Physcion

R282.71

A

1003—6350（2017）03—0441—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.032

2016-04-26)

2014年陜西省自然科學基礎研究計劃項目(編號：2014JM4132)；西安醫學院學科建設經費資助

張存勞。E-mail：1131168159@qq.com