酶法制備薩拉米風味基料的研究

卜冬冬，汪建明，周紅，李秉業，張偉偉

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.山東新泰市檢驗檢測中心，山東泰安 271000；3.山東天博食品配料有限公司，山東濟寧 272000）

酶法制備薩拉米風味基料的研究

卜冬冬1，汪建明1，周紅2，李秉業3，張偉偉3

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.山東新泰市檢驗檢測中心，山東泰安 271000；3.山東天博食品配料有限公司，山東濟寧 272000）

以發酵肉為原料，研究了酶法水解發酵肉制備薩拉米風味基料的工藝條件。通過單因素試驗、正交試驗和模糊數學感官評價法最終確定最佳的薩拉米風味的產生條件，分別為蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3，54℃水解3h，水解度達到24.1%，得到的產物經美拉德反應增香具有濃郁的薩拉米風味。

酶法水解；正交試驗；薩拉米風味；發酵肉

肉味香精是近年來迅速發展起來的食用香精之一，早期的肉類香精主要是利用各種單體香料和其他輔助配料經拌和、調香制備而成，這種方法制備的香精往往特征香氣不足、口感較差。以氨基酸、水解動植物蛋白（HAP，HVP）和還原糖為主要原料制備熱反應香精的技術逐漸被肉味香精生產企業所采用，用此種方法生產的肉味香精產品香味濃郁、成本較低，但由于其原料為非肉源，所以缺少肉類的特征風味和天然香氣。

為了進一步改善肉味香精的質量，酶解法技術應運而生，酶解工藝具有條件溫和，副反應少，有利于營養成分的保留，生產工藝易控制等優點。本文以發酵肉為主要原料，利用酶解技術制備薩拉米風味基料，為后期成品香精的制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

新鮮豬肉市售；復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風味蛋白酶山東天博食品配料有限公司提供。

氯化鈉、甲醛、硫酸、鹽酸、硼酸（均為分析純） 山東天博食品配料有限公司提供。

1.2 主要儀器設備

98-1-B電子調溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C數顯pH計，上海精密科學儀器有限公司；MS403S分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KT840凱氏定氮儀，丹麥福斯有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制作工藝

豬肉糜→發酵→發酵肉→酶解→滅酶→成品。

1.3.2 氨基態氮的測定

采用甲醛滴定法［1］。

1.3.3 總氮的測定

采用凱式定氮法［2］。

1.3.4 水解度的測定［3］

1.3.5 單酶的篩選

準確稱取發酵肉30g，選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶8種蛋白酶分別酶解發酵肉，蛋白酶添加量均0.6%，pH自然，酶解溫度為各蛋白酶的最適溫度，酶解時間2h，通過測定酶解液的水解度來選擇效果最佳的蛋白酶。

1.3.6 蛋白酶的復配

將風味蛋白酶分別與步驟1.3.5中水解度較高的3種蛋白酶以1∶1進行復配，蛋白酶添加量0.6%，pH自然，酶解溫度55℃，酶解時間2h，通過測定酶解液的水解度來選擇效果最佳的蛋白酶組合。

1.3.7 酶解工藝的優化

1.3.7.1 酶解溫度對酶解工藝的影響

準確稱取發酵肉30g，酶解溫度分別為30，40，50，60，70℃，蛋白酶添加量0.6%，酶配比（胰蛋白酶∶風味蛋白酶）1∶1，料水比1∶1，酶解時間2h，通過測定酶解液的水解度來選擇效果最佳的酶解溫度。

1.3.7.2 酶解時間對酶解工藝的影響

在前期試驗的基礎上，酶解時間分別為1，2，3，4，5，6h，通過測定酶解液的水解度來選擇效果最佳的酶解時間。

1.3.7.3 料水比對酶解工藝的影響

在前期試驗的基礎上，料水比分別為1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶3，通過測定酶解液的水解度來選擇效果最佳的料水比。

1.3.7.4 蛋白酶添加量對酶解工藝的影響

在前期試驗的基礎上，蛋白酶∶添加量分別為0.6%，0.8%，1%，1.2%，1.4%，1.6%，通過測定酶解液的水解度來選擇效果最佳的蛋白酶添加量。

1.3.7.5 蛋白酶配比對酶解工藝的影響

在前期實驗的基礎上，酶配比（胰蛋白酶∶風味蛋白酶）分別為1∶1，1.5∶1，2∶1，通過測定酶解液的水解度來選擇效果最佳的蛋白酶配比。

1.3.8 酶解工藝的正交優化試驗

根據單因素試驗結果，選擇對酶解工藝影響較大的四個因素即酶解溫度、酶解時間、加酶量、料水比及空列，采用五因素四水平的正交試驗對酶解工藝進行優化，正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗設計表Table 1Orthogonal test design table

2 結果與討論

2.1 單酶的篩選

不同蛋白酶酶解同一種物質，會使得水解程度和水解產物組成不同［4］，故實驗選取多種性質各異的蛋白酶對發酵肉進行酶解。按照1.3.5進行試驗，單一蛋白酶的酶解效果見圖1。

圖1 單酶對酶解工藝的影響Fig.1Influence of single enzyme on enzymolysis technology

由圖1可知，8種蛋白酶對發酵肉的酶解效果差異較明顯，胰蛋白酶的酶解效果最佳，水解度11.0%；木瓜蛋白酶的酶解效果次之，水解度9.7%；復合蛋白酶的酶解效果僅次于木瓜蛋白酶，水解度8.9%。故胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和復合蛋白酶是單酶酶解發酵肉中效果最好的3種蛋白酶。

2.2 蛋白酶的復配

酶解過程中，蛋白酶具有特異的酶切位點，酶解作用范圍較小，因此選擇復配酶解，可以使得疏水氨基酸被進一步水解。由于風味酶同時具有內切和外切兩種活性，可用于脫除水解液的苦味，改善水解風味［5，6］。故采用風味蛋白酶分別與胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及復合蛋白酶復合酶解發酵肉，在一定程度上提高酶解液的風味、減少苦味。按照1.3.6進行試驗，雙酶的酶解效果見圖2。

圖2 雙酶對酶解工藝的影響Fig.2Influence of double enzymes on enzymolysis technology

由圖2可知，雙酶酶解發酵肉酶解效果的優劣順序為風味蛋白酶＋胰蛋白酶＞風味蛋白酶＋木瓜蛋白酶＞風味蛋白酶＋復合蛋白酶。故風味蛋白酶與胰蛋白酶復合酶解發酵肉的酶解效果最佳，水解度為12.9%。

2.3 酶解條件的優化

2.3.1 酶解溫度對酶解工藝的影響

按照1.3.7.1進行試驗，研究酶解溫度對酶解工藝的影響，結果見圖3。

圖3 酶解溫度對酶解工藝的影響Fig.3Influence of enzymolysis temperature on enzymolysis technology

蛋白酶的活性受溫度影響較明顯，由圖3可知，在一定溫度范圍內，隨著酶解溫度的不斷增加，水解度呈現先升高后降低的趨勢。因為反應溫度太低，酶活力不足，水解較慢，反應不完全；當溫度較高時，部分酶失活，水解不完全。酶解溫度50℃時，水解度達到最高，為18.7%，故酶解溫度50℃時，酶解效果最佳。

2.3.2 酶解時間對酶解工藝的影響

按照1.3.7.2進行試驗，研究酶解時間對酶解工藝的影響，結果見圖4。

圖4 酶解時間對酶解工藝的影響Fig.4Influence of enzymolysis time on enzymolysis technology

由圖4可知，酶解時間從1h增加到3h時，水解度增加速度較快；酶解時間從3h增加到6h的過程中，水解度增加緩慢，最終趨于平穩。酶解時間從2h增加到3h時，水解度提高了24.8%；酶解時間從3h增加到4h時，水解度僅提高了4.22%，從經濟效益考慮，應選擇酶解時間為3h，此時的水解度為16.6%。

2.3.3 料水比對酶解工藝的影響

按照1.3.7.3進行試驗，研究料水比對酶解工藝的影響，結果見圖5。

圖5 料水比對酶解工藝的影響Fig.5Influence of material-water ratio on enzymolysis technology

酶的水解過程是一個可逆過程，料水比直接影響水解氨基酸及多肽的濃度，從而可能影響底物的最終水解度。由圖5可知，隨著料水比比值的降低，水解度呈現先增加后減小的趨勢，在料水比1∶2.5時，水解度最大，為18.2%，故料水比1∶2.5時，酶解效果最好。

2.3.4 蛋白酶添加量對酶解工藝的影響

按照1.3.7.4進行試驗，研究蛋白酶添加量對酶解工藝的影響，結果見圖6。

圖6 蛋白酶添加量對酶解工藝的影響Fig.6Influence of enzyme addtive amount on enzymolysis technology

由圖6可知，隨著蛋白酶添加量的增加，水解度呈現出整體上升最后趨于平緩的趨勢，蛋白酶添加量低于1.2%時，隨著蛋白酶添加量的增加，水解度不斷增加，且增加速度較快，此時，底物尚未被酶飽和，通過添加酶量可以結合更多的底物，在多個酶切位點進行反應［7］；蛋白酶添加量高于1.2%時，水解度略有增加最終趨于平緩，說明底物接近飽和狀態，酶添加量的增加很難提高酶切效率，從節約成本的角度出發，選擇最佳蛋白酶添加量為1.2%，此時水解度為20.1%。

2.3.5 蛋白酶配比對酶解工藝的影響

按照1.3.7.5進行試驗，研究蛋白酶配比對酶解工藝的影響，結果見圖7。

圖7 酶配比對酶解工藝的影響Fig.7Influence of enzyme ratio on enzymolysis technology

由圖7可知，胰蛋白酶∶風味蛋白酶為1.5∶1時，水解度最高，達到20.6%，水解效果最佳，故1.5∶1為最優酶配比。

2.4 酶解工藝的正交優化試驗

根據單因素試驗結果，采用五因素四水平的正交試驗對酶解工藝進行了優化，正交試驗設計見表1，得到的正交試驗結果見表2，根據正交試驗結果得到的正交試驗效應曲線圖見圖8。

表2 正交試驗結果表Table 2Result table of orthogonal test

圖8 正交試驗效應曲線圖Fig.8Effective curves of orthogonal experiment

極差R的大小可以用來衡量實驗中相應因素作用的大小，各因素的極差與空列的極差相比較，比空列極差大說明該因素對酶解效果影響顯著，反之說明該因素對酶解效果影響不顯著；極差R值越大，說明顯著性越高，反之說明顯著性越低。

由表2可知，對正交試驗結果進行極差分析可得極差的大小順序為RC＞RB＞RD＞RE＞RA，可見酶解時間、加酶量及料水比的極差均大于空列，故酶解時間、加酶量及料水比均對酶解工藝影響顯著；而酶解溫度的極差小于空列，故酶解溫度對酶解工藝的影響不顯著。顯著因素從主到次的順序為C（加酶量）＞B（酶解時間）＞D（料水比）。

由圖8可知，最優方案為A3B4C4D4，即酶解溫度54℃，酶解時間3.5h，蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3，考慮到KB3＝0.206，KB2＝0.207，兩者相差極小，為節約成本，A3B3C4D4被考慮在最優方案之列。進行試驗驗證，重復3次，方案A3B4C4D4的水解度24.9%，方案A3B3C4D4的水解度24.1%，綜合考慮，選擇A3B3C4D4為最優方案，即酶解溫度54℃，酶解時間3h，蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3。

2.5 模糊數學評價檢驗

水解度高說明酶解效果好，即被蛋白酶酶解后產生的氨基酸及肽含量高，為后期美拉德反應提供高效反應原料。水解度不同說明酶解液中氨基酸及肽的含量不同，后期美拉德反應產生的風味就會有所差異［8］。對正交試驗最優方案A3B4C4D4（第1組）和方案A3B3C4D4（第2組）進行輕度美拉德增香反應，采用模糊數學評價檢驗法選出最具薩拉米風味的基料，不但克服了感官評定的主觀性和片面性，使模糊的問題數學化，還可使評定結果更趨于合理性［9］。

2.5.1 模糊矩陣建立結果

對正交試驗最優方案A3B4C4D4（第1組）和方案A3B3C4D4（第2組）進行模糊數學評價檢驗，最終確定酶解工藝的最佳條件。則評判對象集 U為：U＝｛u1……ui，……un｝，對于薩拉米風味基料，確定由3項指標組成因素集，即U＝（氣味u1，滋味u2，整體協調性u3）；評判因素V＝（vl，v2，……，vi，……，vm），經過評定小組討論，確立薩拉米風味基料的評語集為V＝（優秀v1，良好v2，一般v3，較差v4），各級評語對應的感官評定標準見表3。

表3 薩拉米風味基料的感官評定標準表Table 3Sensory evaluation standard table of Salami flavor base

根據參考文獻［10］確定其相應的權重向量為：W＝｛w1，……wi，……wn｝＝（0.36，0.34，0.30）。

將每個樣品的質量評價因素進行歸一化處理，得到以下模糊矩陣：

其中j＝l，2為樣品編號，i＝l，2，3為質量評價因素，ril，ri2，ri3分別為第i個評價因素。

10名感官評定員對2組樣品按氣味、滋味、整體協調性3個因素逐一評價，其對應的等級票數分布情況見表4。

表4 感官評定票數分布Table 4Votes＇distribution of sensory evaluation

根據以上規定，得到2組樣品的模糊矩陣：R11＝V11/10……。

2.5.2 模糊變換及綜合評價結果

根據模糊矩陣變化原理：R＝W×A，則第1組樣品的綜合評價結果為：R1＝W×A1＝（0.36，0.34，0.30）×A1＝（0.466，0.344，0.166，0.034）；第2組樣品的綜合評價結果為：R2＝W×A2＝（0.36，0.34，0.30）×A2＝（0.6，0.236，0.134，0.03）。

以上結果說明，第1組樣品有46.6%的感官評定員認為其等級為優秀，34.4%的感官評定員認為其等級為良好，16.6%認為一般，3.4%認為較差。第2組樣品具有最高的隸屬優秀頻率，其綜合感官為優秀的概率為60%，遠遠超過第1組樣品，且只有3%的評定員認為其較差，第2組樣品隸屬良好的頻率較第1組低，但優秀與良好的總隸屬率達到83.6%，是2組樣品中最高的。根據最大隸屬原則認為樣品2的綜合感官最佳，即酶解溫度54℃、酶解時間3h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3。

3 結論

以發酵肉為原料，通過蛋白酶的篩選、復配確定最佳的蛋白酶組合，即風味蛋白酶和胰蛋白酶；通過單因素試驗和正交試驗確定最優酶解工藝，即酶解溫度54℃、酶解時間3.5h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3；最終通過模糊數學感官評價法確定最優的酶解工藝，即酶解溫度54℃、酶解時間3h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3、水解度24.1%，為后期制備薩拉米風味香精奠定了基礎。

［1］GB/T 5009.39－2003，醬油衛生標準的分析方法［S］.

［2］GB 5009.5－2010，食品中蛋白質的測定［S］.

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［5］Jens Adler-Nissen.Control of proteolytic reaction and of the level of bitterness in protein hydrolysis process［J］.Chem Tech Biotechnol，2008，34（3）：215-222.

［6］Gleann Roy.The use of exopeptidases in bitter taste modification［M］.Asaymposium Pennsylvania：Technomic Publishing Company Inc.，1997.

［7］汪曉，李俊霞，王斐，等.酶法水解羊肉制備肉味香精的研究［J］.食品科技，2008（10）：39.

［8］郇興建.利用豬骨制備天然肉味香精的研究［D］.南京：南京農業大學，2012.

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［10］Saiyavit Varavini.Production of meat-like flavor［J］.Science Asia，2000，26：219-224.

Study on Enzymatic Preparation of Salami Flavor Base

BU Dong-dong1，WANG Jian-ming1，ZHOU Hong2，LI Bing－ye3，ZHANG Wei-wei3
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science ＆Technology，Tianjin 300457，China；2.Shandong Xintai Inspection and Testing Center，Taian 271000，China；3.Shandong Tianbo Food Ingredients Co.，Ltd.，Ji＇ning 272000，China）

Study the preparation of Salami flavor base material with enzyme-hydrolyzed fermented meat as raw material.Through single-factor experiment，orthogonal experiment and sensory evaluation method of fuzzy mathematics，the optimum condition for preparation of Salami flavor is defined.The result shows that protease additive amount is 1.4%，material and water ratio is 1∶3，hydrolyzing for 3hunder 54℃.Under such conditions，the degree of hydrolysis reaches 24.1%.The product with better Salami flavor is obtained by Maillard reaction.

enzymatic hydrolysis；orthogonal experiment；Salami flavor；fermented meat

TS202.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.020

1000-9973（2017）03-0085-06

2016－09－04

卜冬冬（1989－），女，碩士，研究方向：食品添加劑。