PCR技術(shù)在復(fù)合調(diào)味料中沙門(mén)氏菌檢測(cè)的應(yīng)用

李 爽

（天津春發(fā)生物科技集團(tuán)有限公司，天津 300300）

PCR技術(shù)在復(fù)合調(diào)味料中沙門(mén)氏菌檢測(cè)的應(yīng)用

李 爽

（天津春發(fā)生物科技集團(tuán)有限公司，天津 300300）

根據(jù)沙門(mén)氏菌基因上的特有序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)食品中沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中涂布平板后的疑似菌落進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，由此來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌。該方法能有效地應(yīng)用在復(fù)合調(diào)味料中沙門(mén)氏菌的定性檢測(cè)，與傳統(tǒng)的驗(yàn)證方法相比，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，更大程度地節(jié)約時(shí)間成本和人力成本。

復(fù)合調(diào)味料；沙門(mén)氏菌；特定序列；PCR檢測(cè)

沙門(mén)氏菌是一種常見(jiàn)的致病菌，可以引起人的食源性疾病［1］，已嚴(yán)重威脅到人類(lèi)健康，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］，同時(shí)它也是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，在國(guó)內(nèi)外報(bào)道的食物中毒中，由沙門(mén)氏菌引起的食物中毒占首位［3］。沙門(mén)氏菌病的病原體屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。已發(fā)現(xiàn)的近1000種（或菌株），按其抗原成分，可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病有關(guān)的主要有甲組的副傷寒甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組的傷寒桿菌和腸炎桿菌等。沙門(mén)氏菌最適繁殖溫度為37℃，在20℃以上即能大量繁殖。

2013年發(fā)布最新的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 29921－2013）規(guī)定，沙門(mén)氏菌在各類(lèi)食品中的限量值均為0，任何食品中都不得檢出沙門(mén)氏菌。在食品行業(yè)中檢測(cè)沙門(mén)氏菌主要應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4－2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》［4］中規(guī)定的微生物檢驗(yàn)法，該方法是目前世界各國(guó)普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法總體可分為5個(gè)步驟：前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定及血清學(xué)鑒定，先對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行菌體培養(yǎng)，而后涂布平板，再根據(jù)平板上長(zhǎng)出的疑似菌落進(jìn)行一系列的驗(yàn)證試驗(yàn)。雖然該方法是迄今為止最確實(shí)的方法，但由于沙門(mén)氏菌血清型繁多，生化特性各異，檢驗(yàn)程序復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，至少需要4～7天才可得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷應(yīng)用和發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）逐漸應(yīng)用于食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外酶促基因擴(kuò)增技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)將靶DNA擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。用該方法檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高及操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)。因此，利用PCR技術(shù)可以建立一種快速檢測(cè)復(fù)合調(diào)味料中沙門(mén)氏菌的方法：根據(jù)沙門(mén)氏菌的特定序列設(shè)計(jì)引物，將國(guó)標(biāo)中涂布平板后的疑似菌落直接進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，由此來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌。本文通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，建立了復(fù)合調(diào)味料中沙門(mén)氏菌的PCR快速檢測(cè)技術(shù)，并且運(yùn)用到實(shí)際的工作中，從而縮短了對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)判定周期，同時(shí)提高了靈敏度，降低了時(shí)間和人力成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 液態(tài)復(fù)合調(diào)味料

雞汁調(diào)味料。

1.1.2 沙門(mén)氏菌菌株

從動(dòng)物糞便中分離獲得。

1.1.3 引物的合成

根據(jù)沙門(mén)氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因上的一段特定序列［5，6］，設(shè)計(jì)合成一段引物，引物長(zhǎng)度為25bp，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為495bp，該引物由上海生物工程公司合成。

引物I：5＇-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GGT G；

引物II：5＇-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A。

1.1.4 其他材料

Taq DNA聚合酶 天津謙泰生物技術(shù)有限公司；dNTP 寶生物工程有限公司；溴化乙錠、瓊脂糖 上海生物工程公司。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

基因擴(kuò)增儀（ABI9700） 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；核酸電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像儀 廣州深華生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

亞硫酸鉍（BS）瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖5g、硫酸亞鐵0.3g、磷酸氫二鈉4g、煌綠0.025g、檸檬酸鉍銨2g、亞硫酸鈉6g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH 7.5±0.2。

木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂培養(yǎng)基：酵母膏3g、L-賴氨酸5g、木糖3.75g、乳糖7.5g、蔗糖7.5g、去氧膽酸鈉2.5g、檸檬酸鐵銨0.8g、硫代硫酸鈉6.8g、氯化鈉5g、瓊脂15g、酚紅0.08g、蒸餾水1000mL、pH 7.4±0.2。

1.2.2 樣品篩選

將雞汁調(diào)味料按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4－2010的檢測(cè)方法進(jìn)行沙門(mén)氏菌檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無(wú)可疑菌落，判定該樣品不含沙門(mén)氏菌，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 單菌落制備

取少量沙門(mén)氏菌菌液混合到雞汁調(diào)味料中，混合后分別用接種環(huán)取液，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板上。在（36±1）℃條件下在BS平板上培養(yǎng)40～48h，在XLD瓊脂平板上培養(yǎng)18～24h（每個(gè)平板做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)）。

將不含沙門(mén)氏菌的雞汁調(diào)味料分別用接種環(huán)取液，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板上。按照上述同樣的方法進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)結(jié)束后取出平板，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4－2010給出的疑似沙門(mén)氏菌在平板上的判定方法（見(jiàn)表1）觀察疑似沙門(mén)氏菌菌落數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 疑似沙門(mén)氏菌在BS和XLD平板上的判定標(biāo)準(zhǔn)

表2 含有沙門(mén)氏菌的平板涂布結(jié)果

不含沙門(mén)氏菌液體的雞汁調(diào)味料直接涂布的BS平板和XLD平板上未出現(xiàn)疑似菌落。

1.2.4 PCR檢測(cè)

對(duì)所有疑似沙門(mén)氏菌的菌落直接挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)（以無(wú)菌水為模板做空白對(duì)照）。

PCR反應(yīng)體系：在50μL反應(yīng)體系中，10XPCR反應(yīng)緩沖液（含Mg2＋）5μL，dNTP（2.5mmol/L）4μL，用滅菌牙簽沾取平板上的單菌落置于PCR反應(yīng)管中作為模板，引物P1，P2各2μL，Taq DNA聚合酶0.25～0.5μL，無(wú)菌水加至50μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；56℃退火1min；72℃延伸1min，經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫5min。

核酸電泳條件：配制濃度為1.5%的瓊脂糖溶液，0.5mg/L，加入溴化乙錠（EB）制作凝膠，在恒壓100V條件下電泳25min，而后取出凝膠在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

對(duì)PCR產(chǎn)物的核酸電泳結(jié)果顯示：挑取疑似菌落116個(gè)，其中113個(gè)能擴(kuò)增出目的條帶且條帶大小在500bp附近，空白對(duì)照無(wú)目的條帶產(chǎn)生，隨即對(duì)這116個(gè)疑似菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)驗(yàn)證，驗(yàn)證的結(jié)果顯示與PCR檢測(cè)結(jié)果一致（圖1為檢測(cè)結(jié)果的部分電泳圖），116個(gè)疑似菌落中有113個(gè)是沙門(mén)氏菌；另外3個(gè)不屬于沙門(mén)氏菌，因此本方法可以直接用于液態(tài)復(fù)合調(diào)味品的沙門(mén)氏菌檢測(cè)，而且可以節(jié)省大量時(shí)間。

圖1 平板中疑似沙門(mén)氏菌的菌落PCR檢測(cè)電泳圖

3 討論

目前食品檢測(cè)中，沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法是涂布平板后對(duì)疑似菌落進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定和血清學(xué)鑒定，方法繁瑣，實(shí)驗(yàn)量大，耗時(shí)耗力。而PCR方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌只需將疑似菌落直接進(jìn)行PCR鑒定即可得出結(jié)果。該檢測(cè)方法特異性好、速度快、省時(shí)省力，能把國(guó)標(biāo)檢測(cè)沙門(mén)氏菌需要的4～7天縮短到2天。

在實(shí)際的工作中，檢測(cè)液態(tài)復(fù)合調(diào)味料時(shí)應(yīng)該先按照國(guó)標(biāo)的方法對(duì)調(diào)味品中的菌體進(jìn)行增菌，而后涂布BS和XLD平板挑取疑似菌落，該檢測(cè)方法也可以用于半固態(tài)或固態(tài)的復(fù)合調(diào)味料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，只需將半固態(tài)或固態(tài)的復(fù)合調(diào)味料用無(wú)菌水稀釋溶解后進(jìn)行增菌培養(yǎng)，再涂布相應(yīng)的平板培養(yǎng)即可，后續(xù)的PCR檢測(cè)基本和上述方法一致。該方法也可延伸到對(duì)復(fù)合調(diào)味料中其他致病菌的定性檢測(cè)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)該致病菌的特定核酸序列，而后優(yōu)化進(jìn)行疑似菌體的PCR程序即可。

［1］郭勝利.136起食物中毒統(tǒng)計(jì)分析［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1999（1）：32.

［2］武和平.不容忽視的沙門(mén)氏菌［J］.國(guó)外畜牧科技，1992，19（2）：50-51.

［3］孟昭赫.食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法注解（微生物學(xué)部分）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1990：365.

［4］GB 4789.4－2010，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)［S］.

［5］Cohen N D，Wallis D E，Neibergs H L，et a1.Comparison of the polymerase chain reaction using genus-specific oligonucleotide primers and microbiologic culture for the detection ofSalmonellain drag-swabs from poultry houses［J］.Poultry Science，1994，73（8）：1276-1281.

［6］Cohen N D，Megruder E D，Neibergs H L，et a1.Detection ofSalmonellaenteritidisin feces from poultry using booster polymerage chain reaction and oligonucleotide primers specific for allmembers of the genusSalmonella［J］.Poultry Science，1994，73：354-357.

The Application of PCR Technology forSalmonellaDetection in Compound Seasoning

LI Shuang
（Tianjin Chunfa Bio-Technology Group Co.，Ltd.，Tianjin 300300，China）

According to the characteristics on theSalmonellagene sequence design primers，the PCR reaction is used for suspected bacterial colonies after being coated in the national standard ofSalmonelladetection in food，use this method to detectSalmonella.This method can be effectively applied in compound seasoning for qualitative detection ofSalmonella，compared with the traditional verification method；this method has strong specificity，high sensitivity and simple operation，it saves more time and manpower costs.

compound seasoning；Salmonella；specific sequence；PCR detection

TS264.9

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.033

1000-9973（2017）03-0138-03

2016－09－12

李爽（1984－），女，助理工程師，主要從事食品微生物檢測(cè)方面的研究。