GPC凈化高效液相色譜法測定辣椒粉中蘇丹紅

倪煒華，鮑曉瑾，翁光燦，周燕

（嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江嘉興 314000）

GPC凈化高效液相色譜法測定辣椒粉中蘇丹紅

倪煒華，鮑曉瑾，翁光燦，周燕

（嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江嘉興 314000）

文章中建立了通過GPC凈化處理，應用高效液相色譜法檢測辣椒粉中蘇丹紅的實驗方法。樣品經乙酸乙酯/環己烷（1∶1）提取，通過GPC分離凈化，濃縮后用乙腈定容，以0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15）以及0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）作為流動相進行梯度洗脫，經高效液相色譜分離，紫外檢測器測定，外標法定量。該方法在0.05～5.0mg/L范圍內呈良好的線性關系，平均回收率為88.1%～98.1%，相對標準偏差為0.90%～4.02%，檢出限為0.0054～0.0088mg/kg。該方法精密度好，靈敏度高，能簡便、快速、準確地測定辣椒粉中的蘇丹紅（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）殘留量。

GPC；高效液相色譜法；辣椒粉；蘇丹紅

蘇丹紅屬偶氮系列染料，是應用廣泛的化工合成染色劑，主要應用于蠟、油彩、汽油等工業領域，目前已確認了有機偶氮染料的毒性，其大多數有致癌性［1］，包括蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ。它的化學成分中含有一種叫萘的化合物，該物質具有偶氮結構，由于這種化學結構的性質決定了它具有致癌性，對人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用，在食品中禁止使用［2］。現有測定蘇丹紅的方法有很多，主要包括HPLC［3］、UPLC－MS［4，5］、酶聯免疫［6］以及流動注射化學發光法［7］等，但最常用的是高效液相色譜法（HPLC）。中國和歐盟［8］均頒布了HPLC測定食品中蘇丹紅的標準方法。國標GB/T 19681－2005使用正己烷萃取，堿性氧化鋁凈化［9］，步驟繁瑣，且氧化鋁難以準確控制活化程度的缺陷，造成方法重現性較差。本文采用GPC凈化，高效液相色譜-紫外檢測器進行色譜分析，外標法定量，測定辣椒粉中違禁使用的蘇丹紅，取得了滿意的效果，方法回收率范圍在88.1%～98.1%。同時，該方法操作簡單，能有效去除雜質干擾，滿足一般檢驗機構的檢測需求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；全自動固相萃取定量濃縮儀 德國LC Tech公司；電子天平；離心機 上海安亭科學儀器廠；氮吹儀美國Orgnomation公司；恒溫水浴振蕩器。

1.2 試劑與材料

蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ均購自Dr.Ehrenstorfer公司，分別用乙腈配成100mg/L的儲備液，4℃保存，使用時根據需要配成不同濃度的標準工作液；乙酸乙酯、環己烷、乙腈、丙酮、甲酸均為HPLC級；水為超純水。

1.3 實驗條件

色譜柱：色譜柱為Agilent公司的SB C18（150mm× 4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；進樣體積：20μL；流動相A：0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15），B：0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）；流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 高效液相色譜分離梯度條件

檢測波長：蘇丹紅Ⅰ，478nm；蘇丹紅Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，520nm。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取

準確稱取2g勻質樣品（準確到0.0001g）于離心管中，加入10mL乙酸乙酯/環己烷（1∶1），漩渦混合，超聲提取30min。8000r/min下離心10min，將上清液全部轉移至GPC進樣瓶中。

1.4.2 凈化濃縮

GPC吸取5mL樣液進行凈化，流速5mL/min，棄去前面1500s的淋洗液，收集接下來的600s淋洗液，最后用240s淋洗GPC柱，將收集液轉移至旋轉蒸發瓶中，45℃旋轉蒸發至干。用1.00mL乙腈溶解殘渣，過0.22μm有機濾膜，供HPLC測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

實驗選擇0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15）以及0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）作為流動相進行梯度洗脫，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的保留時間適宜，峰形良好，且基線穩定。為了使蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的靈敏度足夠高，通過對蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ標準溶液進行光譜掃描，最終確定蘇丹紅Ⅰ的檢測波長為478nm，在蘇丹紅Ⅰ出峰之后，切換波長至520nm，使蘇丹紅Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ在520nm下出峰。

2.2 提取條件的確定

實驗選用乙酸乙酯/環己烷（1∶1）、乙腈、乙醇3種溶劑作提取劑，比較了3種溶劑的提取效率，經過超聲提取，結果表明：提取效率相差不大，樣品中的蘇丹紅提取效率均可達90%以上。考慮到過GPC用到的溶劑為乙酸乙酯/環己烷（1∶1），如果用乙腈或乙醇提取，還要進行溶劑替換，增加了實驗步驟，易造成損失。所以，本實驗最后采用乙酸乙酯/環己烷（1∶1）作為提取劑。

2.3 GPC條件的選擇

將蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ混合標準溶液經GPC柱，進樣量為5mL，流動相為環己烷/乙酸乙酯（1∶1），蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的紫外掃描圖見圖1。

圖1 蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ色譜圖

由圖1可知，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的流出時間主要集中在25.5～34min，并采用分段收集，上液相檢測各階段蘇丹紅含量，最終選擇收集時間為25～35min，其余時間為丟棄時間。

圖2 未過GPC樣品圖

圖3 過GPC后樣品圖

由圖2和圖3可知，GPC凈化能夠有效去除辣椒粉中大量的脂肪及其他脂溶類物質。樣品經過GPC凈化后，可以有效去除樣品中雜質，特別是蘇丹紅Ⅲ，保留時間附近經常會出現雜峰，容易發生誤判。GPC凈化后，可以有效去除這一問題，增加實驗結果的可靠性。

2.4 標準曲線、線性范圍及檢出限

配制蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的混合標準儲備液100.0mg/L，并逐級稀釋成濃度分別為0.05，0.1，0.5，1.0，5.0mg/L系列的標準工作液，進樣量為10μL。以所得峰面積對標準溶液濃度進行回歸分析，線性關系良好。線性回歸方程式、線性相關系數和檢出限（S/N＝3）見表2。

表2 標準曲線及檢出限

2.5 回收率和精密度實驗

以陰性辣椒粉樣品為基體，添加蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的混合標準溶液，按上述方法及儀器條件進行回收率實驗，每個添加水平做6次平行，添加水平、平均回收率及精密度見表3。

表3 回收率及精密度實驗結果

續 表

由表3可知，辣椒粉中蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ含量檢測，添加水平在0.02，0.1，0.5mg/kg時，平均回收率為88.1%～98.1%，相對標準偏差為0.90%～4.02%，符合相關規定要求。

3 結論

本文建立了運用GPC凝膠凈化，高效液相色譜法檢測辣椒粉中蘇丹紅的方法。該方法前處理步驟少，提取效率高，定量限低，精密度和準確度高，特別是可以有效去除雜質干擾，增加結果的可靠性。

［1］Stiborova M，Martinek V，Rydlova H，et al.Sudan I is a potential carcinogen for humans evidence for its metabolic activation and detoxication by human recombinant cytochrome P450 1A1and liver microsomes［J］.Cancer Res.，2002，62（20）：5678-5684.

［2］賈濤.應用液相色譜分析技術測定飼料中蘇丹紅含量的探討［J］.檢測技術，2013（4）：53-58.

［3］周建科，劉瑞英，李曉陽.山楂飴中蘇丹紅的高效液相色譜法測定［J］.現代食品科技，2009，25（2）：208-210.

［4］孫姝琦，田毅敏，杜振霞.超高效液相色譜串聯四極桿質譜聯用分析番茄醬中蘇丹紅i～iv含量［J］.分析測試學報，2007，26：225-227.

［5］Hou X，Li Y，Cao S，et al.Analysis of para red and Sudan dyes in egg yolk by UPLC-MS-MS［J］.Chromatographia，2010，71（1）：135-138.

［6］Hu X，Fan Y，Zhang Y，et al.Molecularly imprinted polymer coated solid-phase microextraction fiber prepared by surface reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization for monitoring of Sudan dyes in chilli tomato sauce and chilli pepper samples［J］.Anal.Chim.Acta.，2012，731：40-48.

［7］牛麗川，宋正華.流動注射化學發光法測定蘇丹紅Ⅰ［J］.分析化學，2009，37（A01）：209.

［8］Vérétout O，Demesse L，Szymanski L.Analysis and dosage of the colorants Sudan and Bixin in chili powder and pepper-based products［R］.Health ＆Consumer Protection Directorate-General，European Commission，News Notification：03/99.

［9］GB/T 19681－2005，食品中蘇丹紅染料的檢測方法高效液相色譜法［S］.

Determination of Sudan Red in Chili Powder after Purification with GPC by HPLC

NI Wei-hua，BAO Xiao-jin，WENG Guang-can，ZHOU Yan
（Jiaxing Institute for Food and Drug Control，Jiaxing 314000，China）

Establish a method to detect Sudan red in chili powder after purification with GPC by HPLC.The samples are extracted with ethyl acetate and cyclohexane（1∶1），separated and purified by GPC，after being concentrated to a definite volume with acetonitrile，with 0.1%formic acid water solution and acetonitrile（85∶15）and 0.1%formic acid in acetonitrile solution and acetone（80∶20）as mobile phase for gradient elution，with high performance liquid chromatography for separating，UV detector for determination and external standard method for quantitative analysis.The calibration curves show good linearity in the mass concentration range of 0.05～5.0mg/L，the average recoveries are from 88.1%to 98.1%and the relative standard deviations are from 0.90%to 4.02%，the limits of detection are 0.0054～0.0088mg/kg.This method is simple，rapid，sensitive and accurate for the determination of Sudan red（I，II，III，IV）residues in chili powder.

GPC；HPLC；chili powder；Sudan red

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.031

1000-9973（2017）03-0130-03

2016－09－14

倪煒華（1982－），男，浙江嘉興人，工程師，主要從事食品添加劑檢測方面的研究。