高效液相色譜-串聯質譜法測定花椒粉中的松香酸

崔相勇，穆姣姣，周長民，張鳳清，陳學輝

（沈陽食品檢驗所，沈陽 110022）

高效液相色譜-串聯質譜法測定花椒粉中的松香酸

崔相勇，穆姣姣，周長民，張鳳清，陳學輝

（沈陽食品檢驗所，沈陽 110022）

采用高效液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）法來測定花椒粉中松香酸的含量。提取方法采用乙醇超聲提取法，以乙腈及水（含0.1%甲酸）為流動相進行梯度洗脫，采用反相高效液相色譜分離，通過帶有電噴霧離子化源的串聯質譜儀，以多反應監測模式檢測。該法線性范圍為0.1～2mg/kg，平均回收率為90%～103%，相對標準偏差≤8.8%，方法的檢出限為0.1mg/kg。

高效液相色譜-串聯質譜法；松香酸；花椒粉；測定；多反應監測模式

松香酸為松香的主要成分，松香為松科植物馬尾松或其同屬植物樹干中取得的油樹脂，經蒸餾除去揮發油后的遺留物。松香中主要成分為樹脂酸，約占85%～95%，而松香酸是樹脂酸的主要成分［1］。有些不法商販在花椒粉生產過程中添加松香，推測目的是為了起到防腐和加香的作用，因此建立花椒粉中松香酸的檢測方法就顯得尤為必要，進而檢測摻假的花椒粉。目前，測定松香酸的方法主要有高效液相色譜法及液相色譜-串聯質譜法［2－6］，測定花椒粉中的松香酸還未見報道。本研究采用LC-MS/MS法來測定花椒粉中的松香酸，提取試劑為乙醇，以乙腈及水（含0.1%甲酸）為流動相進行梯度洗脫，經過反相色譜分離后以多反應監測模式進行檢測。

1 材料和方法

1.1 儀器

API 4000型三重四極桿串聯質譜儀（配有離子噴霧離子源以及Analysis 1.4.2數據處理系統） 美國Applied Biosystem公司；LC-20A液相色譜儀（包括二元輸液泵及自動進樣器） 日本島津公司。

1.2 藥品及試劑

松香酸標準品（含量85.0%），批號：173130250，購自Sigma公司；乙醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；實驗室用水為高純水。

1.3 標準儲備溶液

精密稱取松香酸0.1000g于100mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，作為標準儲備溶液。此標準儲備溶液每1mL相當于1.0mg松香酸。

1.4 色譜條件

色譜柱：資生堂C8柱（2.1mm×50mm，3.5μm顆徑）；流動相：乙腈-水（含0.1%甲酸）；流速：0.4mL/min；柱溫：25℃；進樣量：20μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.5 質譜條件

采用電噴霧離子化源；離子噴射電壓：5000V；溫度：550℃；源內氣體1（GS1，N2）壓力：60psi；氣體2（GS2，N2）壓力：60psi；氣簾氣體（N2）壓力：15psi；正離子方式檢測；松香酸的解簇電壓（DP）為55V，碰撞能量（CE）為20eV；用于定量分析的離子反應為303.4～123.5m/z；用于監測的離子反應為303.4～149.3m/z，碰撞能量（CE）為26eV；松香酸結構及［M＋H］＋的產物離子掃描質譜圖見圖1。

圖1 松香酸的結構及［M＋H］＋的產物離子掃描質譜圖

1.6 花椒粉樣品的預處理

稱取花椒粉樣品1g（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入20mL乙醇，渦旋混勻后超聲提取20min，轉移至25mL容量瓶中，并用乙醇定容至刻度，搖勻后吸取一定量液體經0.22μm濾膜過濾，取20μL供LC-MS/MS分析。

1.7 空白花椒粉萃取液制備

選擇在生產過程中未添加松香的花椒粉。按1.6試樣處理方法提取，經0.22μm有機濾膜過濾。必要時進行LC-MS/MS分析，以確定在松香酸出峰處不存在干擾。

2 結果與討論

2.1 色譜行為和專屬性

按“花椒粉樣品的預處理”操作，分別制備空白花椒粉樣品、空白花椒粉加入松香酸標準溶液（相當于含2mg/kg松香酸的花椒粉樣品）進行測試。典型色譜圖分別見圖2中A和B。結果表明：空白花椒粉中的內源性物質不干擾松香酸的測定。

圖2 測定花椒粉中松香酸的典型MRM色譜圖

2.2 線性范圍和靈敏度

取空白花椒粉萃取液，依次加入適量松香酸標準系列溶液，配制成相當于花椒粉濃度為0.1，0.2，0.5，1，2mg/kg的樣品萃取液，按“花椒粉樣品的預處理”項下操作，記錄色譜圖；以待測物濃度為橫坐標，待測物峰面積為縱坐標，進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為標準曲線，見圖3。結果表明：松香酸在0.1～2mg/kg范圍內線性良好，方法檢出限為0.1mg/kg（信噪比S/N＝3）。

圖3 測定花椒粉中松香酸的典型標準曲線圖

2.3 回收率和精密度

試驗分別制備了相當于含松香酸0.1，0.5，2mg/kg的低、中、高3個濃度花椒粉樣品，按1.6項的操作方法進行處理，每濃度六樣本分析，并與標準曲線同時進行，以當時的標準曲線計算樣品的測得濃度，求得本法的精密度與回收率。低、中、高3個濃度的回收率范圍分別為90%～97%，92%～100%和91%～103%，精密度分別為5.5%，4.6%和8.8%，結果均符合相關要求。

2.4 討論

2.4.1 質譜條件優化

質譜條件優化按以下步驟完成：將濃度為1μg/mL的松香酸標準溶液吸入注射器中，放在蠕動泵進樣器上，設置蠕動泵以20μL/min的速度進樣，對質譜條件進行優化，盡可能地使待測物響應信號達到最高。在優化過程中比較了松香酸正、負兩種離子化方式的響應值，發現正離子化效率高于負離子化效率，而且正離子響應較為穩定，因此選擇正離子掃描方式。

經過Q1全掃描，選擇了響應信號最高的303.4m/z作為松香酸定量分析的母離子，在子離子掃描方式下，尋找到了一些碎片離子，其中123.5m/z響應最高，149.3m/z次之，在多反應監測掃描模式下，選擇303.4～123.5m/z用于松香酸的定量分析。在蠕動泵持續進樣的情況下，對各項質譜參數進行優化，使得待測物響應值達到最高。

2.4.2 色譜條件優化

雖然質譜分析的專屬性較高，但是還需要將樣品中的內源性物質與待測物進行分離，以減少對測定產生干擾，所以在試驗過程中對色譜條件進行了選擇及優化。

松香酸在小粒徑的C18色譜柱上保留較強，色譜峰峰形較差，故試驗中選擇了保留能力較弱的C8柱。應用反相色譜條件時，LC-MS/MS分析方法應用的有機相主要為甲醇和乙腈，選用乙腈作為有機相時，松香酸的色譜行為較好。試驗中考慮到甲酸能夠改善峰形，使待測物與內源性物質充分分離，所以選擇了0.1%的甲酸作為水相。

2.4.3 提取條件的選擇

試驗中考察了甲醇和乙醇作為提取試劑的提取效果，結果發現乙醇的提取效率稍高于甲醇，而超聲提取的使用同樣會提高待測物的提取效率，所以最終選擇了用乙醇作為提取試劑進行超聲提取。

2.4.4 實際樣品檢測

在市面上隨機購買了15批次的花椒粉樣品，均未檢出松香酸。

3 總結

本研究首次采用高效液相色譜-串聯質譜法來測定花椒粉中的松香酸，方法采用MRM進行定量，提高了選擇性與專屬性，排除了內源性物質的干擾。該法靈敏度較高，檢出限達到0.1mg/kg，前處理方法簡單，可應用于食品安全檢測，有較強的實際應用價值。

［1］李富賢，米彩峰，石會麗.RP-HPLC測定清毒素膠囊中松香酸的含量［J］.中國中藥雜志，2008，33（9）：1086-1087.

［2］仇雅靜.高效液相色譜法檢查骨筋丸膠囊中非法添加的松香酸［J］.藥物鑒定，2011，20（4）：39.

［3］張妤琳，曹玲，譚力，等.液質聯用技術用于沉香中非法摻入含松香酸類物質的檢測［J］.中成藥，2011，33（5）：844-847.

［4］陳安珍，沙啟營，單秀明，等.跌打片中松香酸的HPLC和HPLC-MS/MS檢測方法研究［J］.中成藥，2013，35（9）：1940-1942.

［5］王英鋒，魏小燕.HPLC測定楓香脂堿提物中脫氫松香酸和松香酸的含量［J］.中國中藥雜志，2013，38（1）：57-58.

［6］張蘇珍，耿志明，王道營.固相萃取-高效液相色譜法檢測肉鴨表皮組織中的松香酸［J］.食品科學，2014，35（4）：82-85.

Determination of Abietic Acid in Pepper Powder by LC-MS/MS

CUI Xiang－yong，MU Jiao-jiao，ZHOU Chang-min，ZHANG Feng－qing，CHEN Xue-hui
（Shenyang Food Inspection Institute，Shenyang 110022，China）

To develop and validate a sensitive and specific LC-MS/MS method for the determination of abietic acid in pepper powder.The analyte is extracted from pepper powder by ethanol and separated by RP-HPLC with acetonitrile and 0.1%formic acid as the mobile phase.Detection is carried out by multiple reaction monitoring（MRM）on an API 4000LC-MS/MS system with an electrospray ionization（ESI）interface.The assay is linear in a range of 0.1～2mg/kg，and the average recovery is 90%～103%with RSD≤8.8%.The detection limit of the method is 0.1mg/kg.

LC-MS/MS；abietic acid；pepper powder；determination；MRM

TS264.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.030

1000-9973（2017）03-0127-03

2016－09－12

崔相勇（1985－），男，吉林安圖人，工程師，碩士，研究方向：藥物分析與食品檢測。