茶樹分子遺傳圖譜的研究進展

石玉蘭，鄭楚楚，陳 絲，歐淑瓊，彭 靖，王坤波

（湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128）

茶樹分子遺傳圖譜的研究進展

石玉蘭，鄭楚楚，陳 絲，歐淑瓊，彭 靖，王坤波*

（湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128）

簡要概述了茶樹分子遺傳圖譜構建方法和國內外茶樹分子遺傳圖譜研究進展，并由此提出構建高密度茶樹分子遺傳圖譜的措施，為茶樹分子遺傳圖譜的構建提供參考。

茶樹；遺傳圖譜；分子標記

茶樹（Camellia sinensis（L.）O. kuntze）屬于山茶科（Theaceae）、山茶屬（Camellia）、茶組（Sect.Thea（L.）Dyer），起源于我國的西南地區[1]。二倍體（2n=30）的茶樹群體在我國比較常見，但其中仍有茶樹多倍體。茶樹染色體著絲點大部分在中部和近中部，有少數在近端部[2]。山茶花和茶的基因組近似，大概為4000 Mb，約為擬南芥的30倍、毛果楊的10倍。由于世代周期長、基因組大、遺傳負荷大和基因型高度異質雜合等特性，茶樹遺傳基礎的研究十分薄弱。我國茶樹種植歷史悠久，品種資源豐富，大部分目前的栽培品種選育都來自于群體品種，常規育種方法和環境對于性狀的影響和干擾是非常復雜和難以避免的。要選育出一個茶樹新品種最少需要花費10～20年甚至更長時間。因此發展傳統茶樹育種研究迫切需要一些新的技術和理論以實現快速定向培育。

遺傳圖譜又稱連鎖圖譜，是指通過遺傳重組所得到的基因位點在染色體上相對距離的線性圖。遺傳圖譜可以進行QTLs定位，得到連鎖目的性狀基因組片段，然后進行基因圖位克隆，以為分子標記輔助選擇育種奠定良好基礎[3-5]。比較遺傳圖譜后，就能知道基因組進化的信息，接著探索出物種遺傳演化的進程[6]。因此，利用DNA 分子標記構建高密度茶樹遺傳圖譜對育種或者遺傳理論研究都意義重大。

1 遺傳圖譜概述

基因遺傳圖譜的構建是建立在染色體交換和重組基礎上的。細胞的減數分裂，在非同源染色體上的基因獨立存在，自由組合，連鎖基因在同源染色體的非姐妹染色單體上發生交換和重組，重組型配子形成，它占總配子數的比例稱為重組率。重組率的高低取決于染色體交換的頻率，而交換頻率隨基因間距離的增加而增加。因此，它們在染色體上的遺傳圖距可以由基因間的重組率來決定，用重組子來推算重組率即遺傳作圖，并且轉化為遺傳圖譜的距離，然后在連鎖群上把遺傳標記依次排序的過程。經典遺傳圖譜主要是使用細胞學標記、形態標記以及生化標記，構建的圖譜可以間接的反映染色體上功能基因的排序，但是受到標記數目的限制，進展比較緩慢；分子遺傳圖譜指的是采用DNA分子標記來建立的遺傳圖譜，因為這種標記不受外部環境條件以及所取材料影響，而且數量相當的豐富，讓構建高密度遺傳圖譜成為一種可能[7-10]。分子遺傳圖譜的構建包括以下幾個步驟[11]：（1）構建合適的遺傳群體，包括親本的選擇、分離群體類型的選擇及群體大小的確定等，根據遺傳材料間的雜交親和性和親緣關系，確定最佳親本組合；（2）選配作圖親本的分離群體類型以及群體大小等，建立分離群體；（3）利用合適的分子標記進行分析；（4）測定標記基因型；（5）進行連鎖分析，利用計算機軟件進行圖譜構建。

2 茶樹遺傳圖譜構建現狀

茶樹為多年生木本植物，生長周期長且異交，但茶樹遺傳組成高度雜合，可采用F1代作圖群體的“雙假測交”方法構建圖譜?！半p假測交”作圖的原理為：兩個高度雜合的親本當中的許多遺傳位點，在雜交一代即發生分離現象，當其中一親本為雜合位點，另一親本為純合位點時，F1代就出現1∶1分離，即為測交；當親本的雙親都是雜合位點時，雜交一代中出現3∶1分離時為顯性標記；出現1∶1∶1∶1或 1∶2∶1分離時為共顯性標記；因此可用來構建雙親分子連鎖圖和判斷雙親間的同源連鎖群[12]?！半p假測交”法構建遺傳圖譜目前適用于多數木本植物[13-15]。

一直以來對茶樹遺傳圖譜的研究相對其他作物比較滯后。1996年，第一張茶樹遺傳圖譜被田中淳一采用“雙假測交”的方法報道，以RAPD標記對藪北×靜-印雜131的F1分離群體作圖，構建了部分遺傳圖譜（包含6個連鎖群），并發現與炭疽病抗性、抗凍能力、多酚類含量、萌芽早晚相連鎖的RAPD標記；但其由于連鎖群數與茶樹染色體數差異大以及標記數量受限，因此QTLs定位及連鎖分析的精確度并不高[16]。2002年，Hackett等以SFS150為母本的半同胞F1群體，采用RAPD和AFLP標記構建的茶樹遺傳圖譜平均圖距為11.7cM，包含15個連鎖群，126個標記[17]。2005年，國內第一張茶樹遺傳圖譜由黃建安等用69份祁門4號和潮安大葉茶的雜交F1作為實驗材料，使用AFLP標記技術構建，其中母本圖譜的208個AFLP標記分布于17個連鎖群上，總圖距為2457.7 cM，標記間最大距離為42.3 cM，最小距離為1.2 cM，平均間距為11.9 cM；17個連鎖群中，最大的連鎖群分布有43個標記，圖距達514.2 cM，標記間最大距離為27.5 cM，最小距離為1.9 cM，平均間距為12.2 cM[18]。2006年黃福平等使用16個ISSR和46個RAPD標記成功構建了福鼎大白回交l代遺傳連鎖圖，總圖距是1180.9 cM，標記間的平均距離是20.l cM；當中連鎖群LG4覆蓋的遺傳距離最大是309.3 cM，其中LG6包含的標記數最多，總共18個標記，平均距離為15.7 cM[19]。2010年Kamunya等采用42個茶樹后代，成功構建了包含30個連鎖群的連鎖圖譜，總圖距是1411.ScM，標記間的平均距離是14.1 cM；同時進行了茶樹產量的QTL定位，檢測出有23個QTLs位點和產量顯著相關，其中15個QTLs遺傳來自母本，8個遺傳來自父本[20]。另外，日本等國科學家在雙假測交的基礎上，采用ISSR、 AFLP、RAPD和SSR標記同樣構建了茶樹的一部分遺傳連鎖圖[21]。2012年Taniguchi等利用SSR、RAPD、STS和CAPS標記，同時整合了之前的兩張圖譜，是目前為止標記密度最大、基因組覆蓋最全面的茶樹遺傳圖譜，當中以279個SSR標記為主的核心圖譜長度是1218 cM，但是只有54個F1單株的作圖群體[22]。2013年馬建強構建的雙親遺傳圖譜共15個連鎖群，與茶樹染色體數一致，包含1101標記（SSR，373；SNP，728），圖譜覆蓋基因組長度1632.8 cM，相鄰標記間最大距離19.6 cM，最小間距0.1 cM，平均圖距為1.5 cM，連鎖群長度范圍80.2～184.8 cM[23]。

目前為止構建的茶樹遺傳圖譜有的精確度和密度有限，雖然給茶樹遺傳與育種研究帶來了動力，但是要展開有價值的應用還比較困難，造成的原因主要包括：（1）分離群體較小。衡量遺傳圖譜的質量高低是以這些遺傳標記在圖譜中位置的精確性為準而不是取決于標記數目的多少[24]。染色體的同源重組決定了標記在圖譜中的位置順序，所以在構建圖譜時就需要一定數量的作圖個體以確保檢測到減數分裂時的重組事件，因此作圖群體的大小決定了遺傳圖譜的飽和度，同時還決定了從隨機分離結果可以辨別的最大圖距和兩個標記間檢測到重組的最小圖距。由于工作量和成本的限制，需150個左右單株才能構建分子標記框架圖，在進行精細研究某個連鎖區域的時候，要將作圖群體擴大到300個以上[21,25]。（2） 分子標記的數量不足。用于QTLs初步定位的遺傳圖譜就要求標記間平均距離在10 cM以下，如果要進行圖位克隆要求平均距離在1 cM以下。（3） 分子標記的種類。除了少數報道的茶樹遺傳圖譜是利用共顯性SSR標記外，其他的圖譜都是用開發成本相對較低、能夠進行快速作圖的RAPD和AFLP標記為主，但這類標記是對基因組的隨機擴增，重現性和保守性較差，在不同的研究群體中具有一定的差異，因此構建的圖譜及利用圖譜解析的QTLs具有組合特異性，無法進行比較分析；同時在圖譜上發現的標記間和標記與基因間的關聯是一種隨機關聯[26-27]；且因其擴增片段多位于非編碼區，不能直接用于分離目標基因[28]；使其實際應用推廣受限。

3 構建高密度茶樹遺傳圖譜的方法

現階段已建成的遺傳圖譜與實際中應用需求相差較大，因受基因組覆蓋率和圖距等限制，因此，對以下幾點的深入研究十分迫切。

3.1 選擇優良親本

使用分離群體作為遺傳材料構建遺傳圖譜，因為群體親本的選擇將直接影響到遺傳圖譜構建的難易程度和圖譜的應用范圍。一般情況下，茶樹為異花授粉植物，任何雜交獲得的親本都可以為遺傳作圖提供足夠的DNA多態性[29]，除非常相近個體外。當構建茶樹遺傳圖譜時，盡量選擇DNA多態性好與親緣關系遠的材料作為親本。

3.2 增加分離群體個數

擴大分離群體的方式目前有兩種：一是為達到高精度數量性狀定位的要求，作圖的分離群體采用200～300個；二是可先隨機選擇一個小群體構建出框架圖，再進行部分加密，以獲得較為理想的遺傳圖譜。

3.3 分子標記系統的整合和開發

當前所采用的分子標記技術大部分為RAPD、SSR和AFLP。其中RAPD、AFLP為顯性標記，較少單獨使用。其中SSR在基因組中廣泛分布，常被用于遺傳圖譜的構建[29-30]，且具有共顯性、多態性高、重現性好、易檢測等特點，其串聯重復的核心序列為1～6 bp[31-32]，Adams等首次提出表達序列標簽（ESTs），是指從cDNA文庫中隨機挑選的克隆進行5′或3′端測序后得到長為150～500 bp的部分cDNA序列[33]。近年來，以表達序列標簽為基礎開展的茶樹基因鑒定、物種遺傳演化等研究成效顯著[34]。金基強等在1589條茶樹的表達序列標簽中，發掘出分布于346條表達序列標簽中的281個基因編碼區的簡單重復序列[35]；Zhao等從2119條茶樹表達序列標簽中，找到出現頻率為6.8%的180個基因編碼區的簡單重復序列[36]。因此現在茶樹遺傳圖譜研究工作的重點，是尋找可以檢測多個等位位點的共顯性標記和找到直接來源于基因表達序列的等位基因。

3.4 研究適合茶樹自身特點的方法和作圖理論

作圖時如果采用有親緣關系物種的雜交二代或“雙假測交”的方法將會丟失大量的遺傳信息，導致圖譜精確度大大降低。由于茶樹基因型高度雜合，且自交不親和，可用于連鎖分析的子代分離類型達到7種，可配成17種不同的分離類型對[37]。所以研究適合茶樹自身特點的方法和作圖理論，提高遺傳信息的使用效率對構建高密度茶樹遺傳圖譜十分重要。

3.5 開展比較作圖研究

通過比較作圖，對于某物種遺傳圖譜上已定位的新基因，為了大大提高基因定位的效率，可選擇在其親緣關系近的物種的染色體同源區段定位相同的基因。比較作圖揭示了物種基因組間的同源性和差異性，也為物種起源及遺傳演化研究提供了新的依據，而且各物種中可供利用的遺傳標記數量顯著增加[38]。因此，選擇合適的DNA標記開展比較作圖，也是未來茶樹遺傳圖譜研究發展的一個重要趨勢。

綜上，雖然對茶樹的遺傳圖譜研究比較滯后，現在得到的遺傳圖譜精密度也不高，構建方法也尚不完善，但是隨著理論和技術的不斷創新，茶樹遺傳圖譜的研究必將有新的發展。構建遺傳圖譜為提高茶樹的育種效率。建立高密度的茶樹分子遺傳圖譜，定位和目標性狀緊密連鎖的分子標記，有利于在茶樹生長發育初期選擇群體中含有目標基因的植株，推動育種工作和其他應用的順利進展。

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Research Progress in Genetic Map of Tea Plant (Camellia sinensis)

SHI Yu-lan，ZHENG Chu-chu，CHEN Si，OU Shu-qiong，PENG Jing，WANG Kun-bo*
（Tea science ministry of education key laboratory of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

Genetic maps are important tools in plant genomics and breeding. In this paper, the construction procedure of genetic mapping and research progress in genetic map of tea plant were introduced. Therefore, we proposed improved strategies for the construction of genetic map of tea plant.

Camellia sinensis, Genetic map, Molecular markers

S571.1

A

1009-525X（2017）02-03-07

2017-04-21

2017-06-15

國家自然科學基金項目（31470692、31670691和31500567）

石玉蘭（1993-），女，湖南邵陽人，在讀碩士研究生，研究方向：茶葉生物化學。

*通訊作者：王坤波（1976-），男，湖北十堰人，教授，主要從事茶葉功能成分化學和茶樹次生代謝調控的研究。Email：wkboo163@163.com