小麥品種高原115花青素合成代謝的特點

朱雪冰+趙鑫+李建民+魏樂

摘 要：紫色籽粒小麥品種高原115已于2001年通過審定，并在中國西北春麥區進行示范推廣，但目前關于該品種的花青素合成生理特性研究甚少。本研究以紫色籽粒小麥高原115和白色籽粒小麥opata為材料，通過對紫粒小麥高原115和白粒小麥在花青素類化合物化學組織、物質結構差異、籽粒發育過程中花青素含量的變化以及對外界環境反應的研究，從而了解高原115紫色籽粒中花青素合成的特點，更好地利用現有品種，為克隆小麥紫色籽?；ㄇ嗨睾铣傻年P鍵基因打下基礎。

關鍵詞：紫粒小麥；高原115；花青素；合成代謝

花青素是一種植物特有的水溶性色素，是植物中重要的次生代謝產物。目前，育種家們已從小麥中選育出了幾種不同籽粒顏色的小麥（紅、紫、黑、藍），但對其色素形成的代謝途徑及遺傳機理尚不清楚。本研究的目的是以紫色籽粒小麥品種高原115為主要試驗材料較為系統地分析控制小麥籽粒中花青素積累的生理機制。

光是影響花青素合成與積累的主要因素之一，它主要從影響植物的形態建成和生長代謝以及通過激活花青素代謝過程中的調控酶類，以促進花青素的合成。

采用冰凍切片，對紫色籽粒小麥品種高原115花青素的化學組織進行定位，發現高原115籽粒的花青素定位于果皮和種皮。利用HPLC技術，從高原115籽粒中分離得到五種不同的花青素類化合物，測定高原115與Opata（白粒小麥）開花后籽粒中花青素含量的變化。結果發現高原115籽粒中花青素含量高于Opata（白粒小麥）。高原115籽粒中花青素合成開始于開花后14天，到開花后28天籽粒中花青素含量達到最大。通過研究光對開花后不同時期籽?；ㄇ嗨睾铣傻挠绊?，揭示了光在高原115紫色籽?；ㄇ嗨睾铣芍械淖饔谩＝Y果表明光對高原115籽粒的花青素合成具有誘導作用，并影響成熟籽粒的花青素含量。

一、材料與方法

1.材料

紫色籽粒小麥高原115由中國科學院西北高原生物研究所選育并提供；Opata 由International Triticeae Mapping Initiative（ITMI）惠贈。

2.實驗方法

（1）冰凍切片。將樣品室的溫度調整到-20℃并切割樣品到合適的大小，激活Peltier，靜置40秒至制冷機達到最大制冷輸出，室溫條件下將足夠的cryocompound添加到樣品盤上，將樣品盤置于快速冷凍架上，使樣品冷凍至低溫。樣品在冷凍過程中，首先將從周邊開始變白，直至中央留下綠豆大小的反光區，并且會很快隨之消失。此時可將樣品盤插入至切片機的樣品孔中，在切樣之前應先將手輪的手柄鎖死，然后用刀的安全擋板擋住刀刃，且擰松樣品頭的螺絲。將樣品盤的柄插入到樣品頭的定位孔，需保證樣品盤的柄徹底插入到樣品頭的孔中，且與樣品頭充分接觸，擰緊螺絲，將刀插入刀架，且需夾緊刀片；調整刀架上的角度至2℃且調整刀架，使其與樣品相對，除去安全擋板，解鎖手輪，旋轉手輪將樣品修正到合適的大小。將切片厚度調整至15?m，勻速轉動手輪進行切片。將完整的切片用毛筆挑取至樣品室預冷的載玻片上，滴入甘油，蓋上蓋玻片，置于Laica顯微鏡下觀察。

（2） 花青素含量測定。

①花青素提取。將單粒種子置于2.0 mL離心管中，加入1 mL 0.1% HCl-methanol （12N HCl ： 99.9% MeOH 1 ： 35），4°C，靜置48小時后，于13000rpm離心15 min，吸取上清（500 ?l），用于花青素含量測定。

②標準溶液。稱取花青素1 mg （Sigma，43725），并加入0.1% HCl-methanol溶解，定容至25 mL。配成標準溶液，分別精密吸取標準溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10mL并分別置于10 mL容量瓶中，以0.0 mL為空白，分別置于其最大吸收處測定吸收度，以吸收度（A）對濃度（C， ?g/mL）進行線性回歸，得到線性回歸方程。

③樣品測定。為了補償葉綠素對花青素含量測定的影響，花青素含量計算用公式：A530 -（0.25 × A657）（Hasegawa et al. 2001）。

（3）高效液相色譜（HPLC）。

① 樣品提取。利用液氮將樣品冰凍，并進行研磨至變成粉末，加入500 ?l 0.1%鹽酸/甲酸溶液，室溫震蕩器24小時，12000rpm離心20 min，吸取上清，0.45 ?m纖維濾膜過濾。4°C保存。

② 儀器及色譜條件。高效液相色譜分析在WATERS515，監測器為WATERS2996PAD，數據收集和分析是在WATERS工作站下進行（分離柱：C18 反相柱；流動相：1%甲酸（A）和色譜級甲醇（B）；進樣量：20 ?l；高壓限制：4000；開始波長： 190 nm；結束波長： 800 nm；采樣速率： 1.0 mL/min；分離度：1.2）

（4）活體條件下，光對高原115籽?；ㄇ嗨睾铣傻恼T導作用。開花后7天、14天、21天，不同時期將高原115同一穗的同一面或相對的一排籽粒，除其穎殼，使其受到陽光的照射，進行光處理（Light），以沒有去除穎殼作為對照，進行暗處理（Dark），每個處理6個重復。24、48、36小時后，取下暗處理和光處理的種子，拍照后-70℃保存，并測定花青素含量。

（5）離體條件下，光對高原115籽?；ㄇ嗨睾铣傻恼T導作用。取開花后14天高原115的籽粒，徒手剝離后平整擺放在培養皿上，將培養皿放置到光照培養間（光強為100 ?mol/s/m2，23 ℃，16 / 8 h）作為光處理（Light）。將培養皿用錫箔紙包裹，放置到光照培養間（光強為100 ?mol/s/m2，23 ℃，16 / 8 h）中作為對照，進行暗處理（Dark）。處理7天后，取出籽粒進行照相，并進行花青素含量的測定。

（6）光對高原115成熟籽?；ㄇ嗨睾康挠绊?。開花后14天，用黑布將高原115幼穗包裹作為暗處理（Dark）的對象，將同一株不同分蘗的幼穗作為對照，進行光照處理（Light）。每個處理6次重復。籽粒成熟后對籽粒按單株收獲進行拍照，并進行花青素含量測

3.結果與分析

（1）小麥高原115與Opata成熟籽粒冰凍切片的比較。從圖1冰凍切片比較結果顯示，高原115籽粒中花青素在果皮及種皮中都有積累，其糊粉層與Opata的顏色相似。Opata中，果皮呈明顯的透明狀，而種皮有明顯的致密顏色發暗物質的存在，可能是黃酮或其它類黃酮類物質。

（2） 高原115與Opata籽粒中花青素組分的HPLC分析。對高原115籽粒的花青素進行高效液相色譜分析，得到了至少5種不同的花青素類成分，這五種物質占到了高原115紫色籽粒色素含量的98%。對這五種物質進行紫外掃描圖譜分析，發現都有一個528 nm左右的特征峰，故推斷這五種物質是花青素類物質。

（3） 高原115與Opata開花后籽?；ㄇ嗨睾孔兓?。開花后不同天數對高原115和Opata籽粒取樣，照相并存放在-70冰箱中，用于測定花青素含量。發現高原115在14-21天間后開始進行花青素的合成，以后顏色逐漸加深，到35天時顏色深度達到了最大；而Opata沒有明顯的花青素的合成。21天后，高原115與Opata的差異逐漸加大。

（4） 高原115花青素合成受光誘導特性的研究。在高原115種子的發育過程中，在穗子上去除一排籽粒的穎殼，受到光的照射，而相對側籽粒則保留穎殼作為暗處理，48小時后取下暗處理和光處理的種子拍照并進行花青素含量的測定。從開花后7天開始，籽粒中花青素的合成就能受到光的誘導。隨著籽粒的發育時間，籽粒受光誘導的活性增強，7天時，光照48小時后僅能使籽粒的胚的周圍產生花青素，花青素含量變化較小。14天時差異增大，受光誘導的高原115籽?；ㄇ嗨睾铣娠@著上升，花青素合成布滿整粒種子。

高原115籽粒開花后14天，剝離籽粒，平整放置在滅菌的培養皿上。密封好培養皿，放到光照培養間中，7天后觀察籽粒并拍照。光照條件下，籽粒變成了紫紅色，而暗處理的籽粒變成了淡黃色，與Opata成熟籽粒的顏色相似。7天后，離體的種子已經失去了大量的水分，并且細胞已經開始死亡。光照處理后的花青素含量比對照增加了33倍，而暗處理的籽粒花青素含量與對照無明顯差異，所以得出結論，離體條件下，光照處理促進了花青素的合成。

4.討論

本章研究對小麥高原115紫色籽粒中花青素的組織定位、化合物的分離、光誘導特性進行了系統的研究，從而為更好地利用現有品種和克隆花青素合成的關鍵基因打好基礎。

Abdel-Aal等認為紫粒小麥的花青素合成主要在籽粒的果皮。孫群等認為河東烏麥526的色素分布在糊粉層中，而漯珍l號、黑粒小麥76的色素分布在果皮和種皮中。因為花青素易溶于水和有機溶劑，所以石蠟切片和樹脂切片在固定的過程中都會將花青素洗脫。前人研究是用徒手切片，難以獲得足夠薄的切片，且所用材料有所差異，所以得到了不同的結論。本章研究采用冰凍切片的方法，將高原115紫色籽粒的色素定位到籽粒的種皮和果皮。

高建偉等從藍粒小麥中分離到8種花青素化合物。但以飛燕草素（Delphinidin）和矢車蒲素（Cyanidin）為主。而Hu等從藍黑小麥河東烏麥分離到了分離了6種花青素化合物，以Cyanidin-3-glucoside 為主 。Abdel-Aal 的研究結果表明紫粒小麥中花青素的主要成分是Cyanidin-3-glycoside 。本研究中初步分離出五種花青素類化合物。對已經分離到5種花青素進行質譜分析，將有利于進一步了解紫粒小麥中花青素的種類和分子結構。

光對許多植物的花青素的合成具有誘導作用[2，3，7]，但是在小麥紫色籽粒花青素合成中的作用沒有得到研究與證明。本章研究在離體和活體的條件下，對高原115紫色籽?；ㄇ嗨睾铣晒庹T導特性進行了研究，得出結論：光誘導籽粒中花青素的合成。Weiss和Halevy認為光對離體花冠的花青素合成至關重要的，而對活體花冠的花青素的合成起促進作用，沒有光花青素仍然能夠合成，這與本章研究相吻合。離體條件下，光對高原115紫色籽粒的花青素合成至關重要，而活體條件下，高原115籽粒避光后仍有痕量花青素的合成。

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作者簡介：朱雪冰（1992—），女，在讀碩士研究生，主要從事藥用植物研究。

通信作者：李建民，學士，教授，碩士生導師，主要從事藥用植物研究。

基金項目：中國科學院知識創新工程重要方向項目：小麥新品種培育及資源高效利用；國家自然科學基金：典型高產區小麥產量及其相關性狀的QTL分析及育種利用（31260322）；中國科學院西部之光項目。