RUVBL2基因knock—down對Rad51和γ—H2AXfoci的影響

韓瀠儀

摘 要：用脂質體轉染的方法將特定的RUVBL2 siRNA序列轉染到真核細胞，并鑒定其在人肺纖維細胞（MRC5 SV）中的表達，以確保RUVBL2基因的knock-down效果。用Rad51和γ-H2AX的特異性抗體進行免疫熒光染色，應用熒光顯微鏡觀察計數Rad51和γ-H2AX foci的數量。Western blot法證實了siRNA以及轉染的效率，確定了RUVBL2基因的存在有利于誘導DNA雙鏈斷裂（DSB）條件下Rad51和γ-H2AX被招募到DNA損傷位點。

關鍵詞：RUVBL2 siRNA RAD51 γ-H2AX foci

中圖分類號：R113 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2017）01（b）-0200-03

在細胞生命活動過程中，基因組DNA常會受到內源和外源因子的攻擊而發生不同類型的損傷。其中，對細胞最具傷害性的損傷是DNA雙鏈斷裂（double-strand break， DSB）。大分子蛋白復合體INO80就直接參與了DSB修復過程[1]。RUVBL蛋白是INO80復合體的一類重要亞基。RUVBL1（RuvB-like 1）和RUVBL2（RuvB-like 2）同屬于ATPases（AAA+ ATPase）家族成員，是細菌DNA 解旋酶RuvB蛋白在哺乳動物中的同源蛋白[2]。

同源重組是DSB修復的一種重要修復方式，RAD51是一種重要的重組蛋白，主要尋找同源DNA的模板并且幫助在損傷DNA與未損傷DNA修復模板之間產生聯系[3]。在酵母中，INO80復合體在染色體修飾和染色體重組過程中會將RAD51蛋白招募到DNA損傷位點[4]，而在哺乳動物細胞里INO80復合體也會在染色體修飾和染色體重組過程中將RAD51招募到了DNA損傷位點[5]。哺乳動物INO80復合體通過DNA末端切除的作用介導了DSB的修復[6]。RUVBL蛋白的缺失會影響RAD51被招募到DNA雙鏈斷裂位點，從而影響到后續進行的DNA末端切除修復[7]。小鼠和人體細胞內，在含有RUVBL蛋白的TIP60復合體缺失或者活性降低的情況下，RAD51被招募至DNA雙鏈斷裂損傷位點的進程也會被削弱[8]。也就是說RUVBL蛋白在DNA損傷修復過程，尤其是末端切除修復中有著不可替代的作用。細胞在電離輻射等因素作用下直接誘導形成的DSB可誘導H2AX磷酸化成γ-H2AX，γ-H2AX是DNA 雙鏈斷裂的一個標志[9]。細胞在受到DNA損傷后，尤其是DNA雙鏈斷裂后，在斷裂位點會出現由γ-H2AX形成的焦點。γ-H2AX對于其他蛋白募集到焦點起著非常關鍵的作用[10]。INO80復合體通過與γ-H2AX相互作用而使得INO80被招募到DNA雙鏈斷裂處[11]。在人類細胞中，RUVBL就參與了與γ-H2AX的相互作用[12]。由此可以推測RUVBL蛋白在哺乳動物細胞DNA損傷修復的過程中有著重要的作用。

RUVBL1作為INO80的亞基之一，在DSB修復過程中起到了重要的作用，主要體現在誘導H2AX磷酸化變成γ-H2AX，然后將Rad51修復蛋白招募至DSB位點[13]。由于RUVBL2和RUVBL1的同源性，我們猜測RUVBL2和RUVBL1也有相似的作用。為了探究RUVBL2是否也參與了DSB的修復，在人類細胞里用siRNA的方法降低RUVBL2蛋白表達，X射線處理誘導DSB的形成，探索在此種情況下Rad51和γ-H2AXfoci的形成是否會受到RUVBL2蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胚肺成纖維細胞MRC5 SV細胞系為本實驗室保存，脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，DMEM培養基購自Nissui公司，新生胎牛血清購自Biological Industries公司，兔抗RUVBL2（EPR4146）抗體購自Abcam 公司，HRP 標記山羊抗兔IgG（474-1516）購自KPL公司，β-Tubulin抗體（T8328）購自 Sigma公司，HRP標記抗鼠IgG （sc-2005）購自Santa Cruz Biotechnology公司，ECL 發光試劑盒購自Promega公司，DAPI細胞核熒光染劑購自WAKO公司，RAD51抗體（70-002）購自Bio Academia公司，γ-H2AX 抗體（05-636）購自MILLIPORE公司，鼠抗（Alexa Fluor 546）購自Invitrogen公司，兔抗（Alexa Fluor 488）購自Invitrogen公司，熒光封閉劑購自DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

人肺纖維細胞MRC5-SV細胞系用于進行RUVBL2 knock-down的實驗。細胞系培養于DMEM培養基，內含有10% 胎牛血清，L-谷氨酰胺（584μg/mL）和卡那霉素（20 μg/mL）。細胞放置37°C，5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 siRNA

MRC5-SV細胞培養于直徑為10 cm的培養皿中，當細胞密度達到約50%左右，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）轉染試劑將RUVBL2 siRNA （2～30 nM） 轉入細胞。1 d以后將細胞分裝成4盤，3d以后收集細胞檢測蛋白。siRNA序列為5-gctccacgcagtacatgaaggagta-3。

1.2.3 Western blot分析

細胞培養5 d后收集細胞，低溫RIPA 緩沖液（25 mM Tris-HCl （pH 7.6），150 mM，NaCl，1% NP-40，1% sodium deoxycholate和0.1% SDS） 重懸細胞，補充1 mM PMSF 放置10min， 渦旋震蕩2次，2 s/次，4°C，22，000 ×g離心20 min，取上清。蛋白濃度的測定用BCA protein assay kit （Pierce）。蛋白樣品上樣至7.5%SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉膜儀Trans-Blot Turbotransfer system （BIO-RAD）的作用下蛋白被轉移至PDVF 膜。TBST（20 mM Tris-HCl（pH 7.6），150 mM NaCl和0.1% Tween 20）清洗PDVF膜。 用含有1% BSA 的TBST封閉PDVF膜，封閉后用TBST清洗。加入RUVBL2抗體（1：5000稀釋），4 ℃ 過夜； 次日用TBST洗3次，10 min/次；加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（KPL 474-1516， 1：5000稀釋），37 ℃，1 h； TBST 洗3 次，10 min/次。β-Tubulin作為對照蛋白，加入β-Tubulin抗體（1：5000稀釋），4 ℃過夜；次日用TBST洗3次，10 min/次； 加入HRP 標記的抗鼠二抗（1：2000稀釋）。用ECL顯色，ChemiDoc XRS+ system（BIO-RAD）化學發光凝膠成像系統中檢測雜交信號。目標條帶密度將由Precision Plus Protein WesternC Standard（BIO-RAD）進行計算。

1.2.4 foci免疫熒光染色

細胞需要培養于蓋玻片上：用鑷子將高溫滅菌后的蓋玻片（MATSUNAMI S2112 microslide glass）放進直徑為10 cm的培養皿中，每片蓋玻片承載500 uL的細胞懸液（細胞懸液的濃度約為5×105個細胞/mL）。細胞培養箱培養30 min，細胞于蓋玻片附著穩定后，加入10 mL培養基，培養箱中培養24 h。24 h后，真空泵吸除細胞培養基，10 mPBS清洗兩次。將蓋玻片浸泡于冰甲醇里，冰箱放置20 min，取出蓋玻片，移除殘留甲醇后，在冰丙酮里浸泡7 s后迅速取出干燥。加入300 uL封閉液封閉蓋玻片，室溫反應20 min。加入150 uL γ-H2AX/ RAD51抗體（10%BSA 15μL，γ-H2AX 1：150，RAD51 1：400稀釋于PBS），4 ℃過夜；次日用PBS 洗3次，10 min/次；加入二抗150 uL（10%BSA 15μL，抗鼠二抗1：500，抗兔二抗1：1000稀釋于PBS），37 ℃，1 h；PBS 洗3次，10 min/次。將蓋玻片放入有0.05% tween20%PBS 的罐子里避光放置5 min。取出蓋玻片吸干PBS。將100 uL細胞核染液（DAKO：DAPI=1：500）均勻夾在固定有細胞的蓋玻片上。將蓋玻片放置在載玻片上，用指甲油封住邊緣處。最后用熒光顯微鏡（Olympus FluoView）進行觀察。

2 結果與分析

2.1 siRNA效果檢測

siRNA序列作用于RUVBL2 mRNA。siRNA被轉染進入MRC5-SV細胞， 用Western blot分析法分析了轉染3 d后siRNA對RUVBL2 knock-down的效果。最適knock-down濃度為10 nM siRUVBL2，如圖1所示。

2.2 RUVBL2knock-down對γ-H2AX的影響

如圖2所示，沒有抑制RUVBL2蛋白表達時，經X射線照射誘導了DSB形成后，γ-H2AX的foci數量很多，但是抑制了RUVBL2蛋白的表達，再經X射線處理，γ-H2AX foci數量明顯要比RUVBL2表達沒有被抑制時的γ-H2AX的foci數量要少，這說明RUVBL2有可能參與；了DSB誘導γ-H2AX的形成。

2.3 RUVBL2的knock-down對RAD51 foci的影響

沒有抑制RUVBL2蛋白表達時，經X射線照射誘導了DSB的形成，RAD51的foci數量很多，但是抑制了RUVBL2蛋白的表達，再經X射線處理，RAD51 foci數量明顯要比沒有被knock-down的細胞RAD51的foci數量要少（圖3），這說明siRUVBL2影響了RAD51被招募到細胞核，間接說明RUVBL2參與了將RAD51招募到DSB損傷位點處的作用。

3 結論

從熒光免疫的實驗來看，我們可以說RAD51和γ-H2AX的foci是受到了RUVBL2 knock-down的影響。對于對照處理細胞來說，10Gy X射線處理過的細胞里RAD51和γ-H2AX的foci數量明顯要比沒有被射線照射的細胞多。由此我們可以初步得出以下結論：RUVBL2參與了招募RAD51至損傷位點的進程，一旦RUVBL2缺失，將會阻礙DNA損傷觸發細胞周期中的信號傳導等一系列級聯反應，阻礙RAD51被招募到DNA損傷位點。

因此，這個結果揭示了抑制RUVBL2的表達會影響DSB誘發的RAD51分配失調進而阻礙DNA損傷修復應答的進程。

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