茅臺大曲中酵母的分離、鑒定及其功能初探

王曉丹，陳美竹，班世棟，邱樹毅,*

（1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

茅臺大曲中酵母的分離、鑒定及其功能初探

王曉丹1,2,3，陳美竹1,2，班世棟1,3，邱樹毅1,3,*

（1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

采用可培養方法對醬香型白酒大曲中的酵母菌進行計數和篩選，通過形態學特征、生理生化實驗及酵母26S rDNA分子生物學方法鑒定酵母，并分析酵母的發酵能力和風味成分。結果表明，醬香型大曲中酵母數量為103CFU/g；共分離鑒定6 種酵母，各酵母產香能力不同，編號FBKL2.0071扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）固態發酵物具有濃郁的果香味，其中以乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯含量較高。編號FBKL2.0082多株伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）固態發酵物呈濃郁的花香味，其中以乙酸乙酯、乙酸異戊酯和苯乙醇含量較高。這兩株酵母固態發酵時都能產生大量的酯類和醇類等揮發性香味物質，還有少量醛、酮、酚和烷類等物質。分離得到的酵母產酒能力不同，總體產酒能力不高。

醬香型大曲；酵母；風味成分；產酒性能

酵母從醬香型白酒制曲、堆積和窖池發酵整個釀造過程中均能檢出，是醬香型白酒釀造微生物家族的重要成員之一[1]。高溫制曲工藝是醬香型白酒生產的一大特色，曲磚發酵時間長，發酵中后期品溫高達60 ℃以上。早前研究認為發酵制曲的前期酵母菌大量繁殖，但是中后期高溫環境不適宜酵母生長，隨著制曲發酵過程中品溫逐漸升高，酵母菌生長被抑制，在發酵中后期僅能少量或不能檢出酵母[2]。雖然利用傳統分離方法可從高溫成品曲中檢出酵母，但數量較低為103～105CFU/g，低于細菌數量2～3 個數量級，而免培養的手段能檢測出酵母數量占醬香型大曲真菌數量的2.6%[3-5]，因而在醬香型白酒高溫成品大曲中仍然存在一定數量的酵母。從醬香型大曲中檢測出的酵母包括假絲酵母屬（Candida）、酵母屬（Saccharomyces）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、地霉屬（Geotrichum）、畢赤酵母屬（Pichia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）、漢遜酵母屬（H a n s e n u l a）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、德巴利酵母酵母屬（Debaryomyces）、絲孢畢赤酵母屬（Hyphochia）等屬的酵母[1]。

目前，對醬香型白酒中酵母功能的研究主要包括對產酒酵母和產香酵母的篩選。產酒酵母主要影響醬香型白酒的產量，而產香酵母對醇和酸具有較強的酯化能力，產生的物質對酒體風格形成具有重要作用[6]。從醬香型白酒生產中分離到的卡斯特假絲酵母（Candida casterllani）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）MT-14、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、Kazachstania exigua、白地霉（Geotrichum candidum）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、克柔念珠菌（Candida krusei）等酵母變現出較好的發酵能力[7-9]。而分離到的平常假絲酵母（Candida inconspicua）和庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、意大利酵母（Saccharomyces italicus）、地生酵母（Saccharomyces telluris）、Saccharomyces cerevisiae、間型假絲酵母（Candida intermedia）、膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、Candida krusei、拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、Kazachstania exigua、白地霉（Galactomyces geotrichum）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、漢遜酵母屬（Hansenula）等酵母在一定條件下表現出較好的產香能力[3,6,8,10]。

本研究對醬香型白酒高溫大曲中酵母數量、種類和功能特性進行了分析，旨在為改善醬香型白酒生產挖掘優質功能酵母資源，為醬香型大曲的科學生產和管理提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

醬香型白酒高溫大曲為貴州茅臺酒股份有限公司釀酒車間粉碎后的生產用曲，取樣時間為2015年10月。

酵母DNA提取試劑盒 美國Biomiga公司；美藍染液北京諾博萊德科技有限公司；其他試劑均為分析純。

固態產香培養基[3,6]：小麥全粉碎，高粱整粒-碎粒質量比3∶1，高粱-小麥質量比1∶1，稱量混勻，加入95 ℃潤糧5 h（水為50%～60%），121 ℃滅菌20 min，無菌條件下按200 U/g淀粉加入糖化酶，60 ℃處理2 h，裝瓶115 ℃滅菌20 min備用。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）上層培養基（培養基冷卻至60 ℃左右，在無菌條件下加入0.05%的TTC染色劑溶解混勻倒平板）、麥氏培養基、缺維生素培養基、氮源基礎培養基、碳源基礎培養基配制參照文獻[11-13]。葡萄糖發酵培養基：葡萄糖20%，酵母膏1%，(NH4)2SO40.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，115 ℃滅菌 20 min[14]。麥芽汁培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、玉米粉瓊脂培養基和孟加拉紅培養基均購于上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HP6890/5975C氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀 美國安捷倫公司；GT10-1型高速離心機 北京時代北利離心機有限公司；PTC-100型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母計數

稱取大曲樣品10 g至裝有玻璃珠的90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，混勻備用。無菌條件下取上清液進行梯度稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度梯度的菌液1 mL于孟加拉紅培養基，傾注法培養計數。培養條件為30 ℃培養2 d，計數范圍為30～300 個，做3 個平行[15]。

1.3.2 酵母分離篩選

根據計數結果，按1.3.1節進行菌液稀釋，取1 mL 10-3梯度菌液于孟加拉紅培養基上，用涂布棒涂布均勻，于30 ℃培養2 d，挑選不同且具有典型酵母菌落形態特征的菌株在平板上劃線純化，酵母菌落質地均勻，正面與反面以及邊緣與中央部位的顏色較一致，菌落一般較大，黏稠，隆起，表面和邊緣光滑或粗糙，多數為乳白色，少數為紅色、黑色等[16]，再挑取單菌落進行斜面保存并編號，重復實驗3 次。

1.3.3 形態特征觀察

將菌株接種于PDA培養基，30 ℃倒置培養3 d，觀察并記錄菌落形狀、顏色、透明度、邊緣、質地、濕潤程度等菌落特征；在載玻片上滴加一滴美蘭染液，用接種環涂布少許菌體并蓋上蓋玻片，100 倍油鏡下觀察細胞形態特征；將酵母接種于玉米粉瓊脂培養基和麥氏培養基上，30 ℃培養數天，分別觀察假菌絲和子囊孢子[12]。

1.3.4 生理生化實驗

對酵母菌進行碳源同化實驗、氮源同化實驗、產類淀粉實驗、脲酶實驗、產類淀粉實驗[12]，并參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》加以對比鑒定判斷[13]。

1.3.5 分子鑒定

酵母菌DNA提取以及26SrDNA D1/D2區域的PCR擴增[17]；引物：NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3’）/NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’），引物對合成及PCR產物測序由上海立菲生物技術有限公司完成；將測序數據在GenBank數據庫中進行同源序列搜索（BLAST search，http://blast.ncb-i.nlm.nih.gov/Blast. cgi），選取同源性較高的相關菌株的26SrDNA D1/D2區域序列作為參比對象[18-19]；用MEGA5.05軟件進行多序列比對，采用Kimura2模型計算進化距離，并用鄰接法（Neighbor-Joining）法構建系統發育樹。進化樹拓撲分析為1 000 個重復取樣的結果[18]。

1.3.6 酵母產香特性分析

酵母產香初級評定：將酵母菌株接種在50 mL麥芽汁液體培養基，30 ℃、160 r/min培養48 h，對發酵液的酯、酸、酒味進行感官評價，氣味強度按照數字1～10逐漸升高，數值越高接受性越強，篩選總體可接受性最好的酵母進行固態產香實驗。

產香酵母固態發酵：將篩選出的酵母接入20 mL麥芽汁液體培養基，30 ℃、160 r/min擴培24 h，按4%的接種量接入固態產香培養基中，發酵5 d，篩選出產香最好的酵母利用GC-MS進行揮發性成分分析[3]。

1.3.7 酵母產酒特性分析

酵母菌30 ℃培養48 h后在酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）上長出單菌落，傾入融化45 ℃左右的TTC上層培養基，覆蓋菌落，避光保存3 h，隨時觀察菌落的顏色變化。由菌落呈色的深淺來判定酵母產酒精能力的大小，選取顏色較深的菌株進行產酒實驗[20]。將篩選的酵母接入20 mL麥芽汁發酵培養基中，30 ℃搖床160 r/min擴培24 h，再按4%比例接種至葡萄糖發酵培養基中，密封發酵5 d，記錄CO2總質量損失量，并測定酒精度以及殘糖量。酒精度測定詳見文獻[12]；利用直接滴定法來測定發酵液中殘糖量，具體做法參見GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》[21]。

2 結果與分析

2.1 計數與篩菌

醬香型大曲中酵母數量為103CFU/g，共分離篩選出12株酵母。觀察酵母的單菌落形態，形狀均為圓形，記錄結果如圖1和表1?？煽闯?，分離出的12 株酵母多為圓形，直徑大小在5～9 mm，邊緣多為完整，菌落易挑起，不透明。

圖1 酵母單菌落圖Fig.1 Single colonies of yeasts

表1 茅臺大曲酵母單菌落形態描述Table1 Description of single colony morphology of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

由表2和圖2可看出，分離到的12株酵母在熒光顯微鏡下除FBKL2.0075、FBKL2.0076、FBKL2.0080外其余菌株均能產子囊孢子和假菌絲，均以芽殖方式繁殖，在掃描電子顯微鏡下細胞形態均為圓形或卵圓形。

表2 醬香型大曲中酵母顯微形態描述Table2 Description of microscopic morphological features of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

圖2 醬香型大曲中酵母掃描電鏡圖Fig.2 SEM observation of the morphological characteristics of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

2.2 生理生化實驗結果

表3 醬香型大曲中酵母生理生化實驗Table3 Physiological and biochemical properties of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

由表3可知，FBKL2.0071和FBKL2.0081與Saccharomycopsis fibuligera相似；FBKL2.0073與長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）相似；FBKL2.0072、FBKL2.0078、FBKL2.0079和FBKL2.0082與Hyphopichia burtonii相似；FBKL2.0074和FBKL2.0077與Issatchenkia orientalis相似；FBKL2.0075和FBKL2.0076與Cryptococcus相似；FBKL2.0080與紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）相似。

2.3 26S rDNA測序和系統發育分析

將各酵母測序數據在GenBank數據庫中進行同源序列搜索（BLAST search），實驗菌株與已知菌株序列之間的最高同源性均不小于99%，系統發育樹見圖3。結合生理生化實驗和細胞形態特征，對上述酵母進行鑒定。

結合以上實驗，將FBKL2.0071和FBKL2.0081鑒定為Saccharomycopsis fibuligera，該菌與扣囊擬內孢霉（Endomycopsis fibuligera）同物異名[22]；FBKL2.0074和FBKL2.0077鑒定為Issatchenkia orientalis；FBKL2.0073鑒定為Lodderomyces elongisporus；FBKL2.0072、FBKL2.0078、FBKL2.0079和FBKL2.0082鑒定為Hyphopichia burtonii；FBKL2.0080鑒定為紅冬孢酵母（Rhodosporidium fl uviale）；FBKL2.0075和FBKL2.0076鑒定為新型隱球酵母（Cryptococcus neoformans）。

此次所分離到的酵母與以往研究相比，Saccharomycopsis fibuligera、Issatchenkia orientalis和Hyphopichia burtonii在醬香型白酒高溫大曲中均有報道。在篩菌過程中，以類似Saccharomycopsis fibuligera表型出現的酵母最多；通過對多種大曲變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）圖譜進行分析，表明高溫大曲中依然存在多種酵母，其中Saccharomycopsis fibuligera和異常畢赤酵母（Pichia anomala）在醬香大曲中處于優勢地位，與本研究結果具有相似性[22]；此外從燒酒曲、清香型小曲酒醅中曾分離鑒定出Saccharomycopsis fi buligera[23-24]。從醬香型高溫大曲、醬香型白酒酒醅及醬香型白酒釀造過程均檢測分離到東方伊薩酵母，其代謝產物對醬香型白酒風味物質貢影響很大[1-17]。利用Biolog微生物自動鑒定系統對濃香型大曲分離到的一株酵母菌進行鑒定為伯頓絲孢畢赤酵母[25]。

圖3 醬香型大曲酵母系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

Lodderomyces elongisporus、Rhodosporidium fluviale、Cryptococcus neoformans屬首次從醬香型白酒高溫大曲中分離到[1]。Lodderomyces elongisporus從葡萄酒發酵過程曾篩選到，對葡萄酒釀造有較好的增香作用[26-27]；該酵母是益生菌，能調節腸道微生態的變化，提高動物機體的免疫力[28-29]。Rhodosporidium fl uviale最先是從亞熱帶鹽漬環境中分離到[30]，后來在煙臺干紅葡萄酒發酵過程也有發現[31]。Cryptococcus neoformans是臨床上常見病原真菌[32-33]，是否為大曲中的酵母種類，在大曲中其作用未知，還有待進一步驗證。

2.4 酵母產香特性

對分離鑒定出的酵母進行液態發酵產香實驗，感官評價見表4。由表4可知，大曲中酵母的產香能力有明顯差異，同種之間產香感官特征較為接近。分離出的酵母產香均良好，產香綜合能力大于15的酵母的有6 株。選取這6株酵母進行固態產香實驗，實驗表明，FBKL2.0071固態發酵產物呈濃郁的果香味，FBKL2.0082固態發酵產物呈濃郁的花香味，兩株酵母固態物香味均濃郁且柔和。

表4 醬香型大曲酵母產香感官評價Table4 Sensory evaluation of aroma-producing yeasts in Moutai-f l avor Daqu

2.5 FBKL2.0071和FBKL2.0082固態發酵產物揮發性物質分析

表5 FBKL2.0071固態發酵物揮發性產物氣味分析Table5 Smell analysis of volatile compounds produced by FBKL2.0071 in solid-state fermentation

表6 FBKL2.0082固態發酵物揮發性產物氣味分析Table6 Smell analysis of volatile compounds produced by FBKL2.0082 in solid-state fermentation

將兩株酵母固態發酵物經固相微萃取后進行GC-MS分析檢測，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數，對比分析，得到酵母固態發酵物中的揮發性組分名稱及相對百分含量，見表5和表6。

結合表5和表6可以看出：1）兩株酵母固態發酵時都能產生大量的揮發性香味物質，這些揮發性香味物質主要是酯類和醇類物質，還有少量醛、酮、酚和烷類等物質。2）FBKL2.0071固態發酵物揮發性香味成分中，多種產物也在不同程度上呈現出果香和花香等氣味，其中以帶有果香味的乙酸乙酯、有香蕉和梨的氣味的乙酸異戊酯、具有玫瑰香氣的苯乙醇、具有甜蜜香味的乙酸苯乙酯、具有果爵和奶油香氣的棕櫚酸乙酯含量較高；其固態發酵物感官評定呈現濃郁的果香味，是這些揮發性香味物質的共同作用結果。3）FBKL2.0082固態發酵物揮發性香味成分中，以有果香味的乙酸乙酯、有香蕉和梨的氣味的乙酸異戊酯和具有玫瑰香氣的苯乙醇含量較高，而其他產物也在不同程度上呈現出花香。

2.6 酵母發酵能力篩選

TTC是一種是脂溶性光敏復合顯色指示劑，原本無色，但是在脫氫酶的作用下被還原為紅色的甲臢化合物TPF（1,3,5-triphenylformazan），因而可以通過酵母菌落在TTC下的變色程度來判定酵母呼吸酶活性和產酒性能的高低[19]。酵母TTC篩選結果如表7所示。

表7 茅臺大曲酵母發酵特性初步評判Table7 Fermentation characteristics of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

由表7可以看出，在相同條件和培養時間內，各酵母在TTC下呈色深淺不一（表中逐行顏色加深），這說明醬香型白酒大曲中酵母的產酒能力強弱不一。相比之下，顯色較深的FBKL2.0072、FBKL2.0078、FBKL2.0079可能具有更好的產酒能力，因而進行進一步發酵實驗來進行分析。發酵結束時，通過考察CO2質量損失量、酒精度以及殘糖量等指標，以安琪酵母為參比對象，來對這些酵母的發酵性能做進一步評判，結果見表9。

表8 酵母發酵液中CO2總質量損失量、酒精度、殘糖量分析Table8 Total CO2loss, alcohol concentration and residual sugar in yeast fermentation broths

由表8可以看出，在相同培養條件和發酵條件下，從醬香型白酒高溫成品大曲中篩出的酵母總體發酵力弱，糖利用率低。同產酒初篩實驗比較分析，TTC培養基中反應呈粉紅色的酵母產酒能力明顯較低，從而也反映了TTC培養基在初步分析酵母產酒能力時具有較好的效果。

3 討論與結論

醬香型大曲中酵母數量為103CFU/g，共分離篩選出12 株酵母。經過形態觀察、生理生化實驗及分子鑒定，最終鑒定為6 種酵母，即Saccharomycopsis fi buligera、Issatchenkia orientalis、Hyphopichia burtonii、Cryptococcus neoformans、Lodderomyces elongisporus和Rhodosporidium fluviale。 Cryptococcus neoformans、Lodderomyces elongisporus和Rhodosporidium fluviale為首次在白酒大曲中發現的酵母種類。

產香實驗表明，大曲中分離的酵母有6株具有較好的產香能力。其中，FBKL2.0071固態發酵物呈濃郁的果香味，FBKL2.0082固態發酵物呈濃郁的花香味，兩株酵母固態物香味均濃郁且柔和。GC-MS揮發性成分分析表明，兩株酵母固態發酵物中含有大量的酯類和醇類物質，也能產生少量的醛、酮、酚和烷類物質。產酒實驗表明，分離的酵母總體發酵能力較弱，糖利用率低。

Saccharomycopsis fibuligera是大曲上霉的主要微生物，廣泛存在于成品曲中。該菌能夠表達生淀粉液化酶和糖化酶，被認為是產生淀粉分解酶類的最好的子囊酵母菌之一，同時具有產酯能力[21-23]。本實驗中分離到的Saccharomycopsis fi buligera既能產酒又能產香。

[1] 陳美竹, 邱樹毅, 胡寶東, 等. 醬香型白酒釀造體系中酵母菌研究進展[J].中國釀造, 2015, 34(6): 5-10. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.002.

[2] 蔣紅軍. 茅臺酒制曲發酵過程中微生物演替及作用規律[J]. 釀酒科技, 2004(3): 39-40. DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2004.03.009.

[3] 龐博. 醬香型大曲酒釀造過程酵母微生態及功能菌株篩選[D].貴陽: 貴州大學, 2014.

[4] 吳徐建. 醬香型白酒固態發酵過程中酵母與細菌群落結構變化規律的研究[D]. 無錫: 江南大學, 2013.

[5] 王彩虹. 基于克隆文庫法研究不同香型大曲微生物群落結構[D].自貢: 四川理工學院, 2014.

[6] 沈怡方. 白酒生產技術全書[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2013.

[7] 趙爽, 楊春霞, 竇屾, 等. 白酒生產中釀酒微生物研究進展[J]. 中國釀造, 2012, 31(4): 5-10. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2012.04.002.

[8] 黃永光, 諶永前, 吳廣黔, 等. 醬香白酒堆積發酵過程酒醅中酵母菌的分析研究[J]. 釀酒科技, 2013(6): 8-13.

[9] 陳良強, 吳群, 徐巖. 醬香型白酒低產雜醇油粟酒裂殖酵母特性的研究[J]. 工業微生物, 2013(3): 1-6. DOI:10.3969/ j.issn.1001-6678.2013.03.001.

[10] 姚翠萍, 王和玉, 林琳, 等. 一株膜璞畢赤酵母的生理特性及其代謝產物研究[J]. 釀酒科技, 2011(7): 57-59.

[11] 毛志群. 高產酒精酵母的篩選及鑒定[J]. 食品與發酵工業, 2003(3): 50-53. DOI:10.3321/j.issn:0253-990X.2003.03.012.

[12] 郜希璐. 白酒窖泥中酵母菌的分離鑒定及發酵特性研究[D]. 天津:天津大學, 2009. DOI:10.7666/d.y1677210.

[13] 巴尼特, 佩恩·亞羅. 胡瑞卿譯. 酵母菌的特征與鑒定手冊[M]. 青島:青島海洋大學出版社, 1991.

[14] 劉慶軍. 新疆野生酵母的耐受性、發酵特性及生產適用性研究[D].濟南: 山東輕工業學院, 2009. DOI:10.7666/d.y1544792.

[15] 沈萍, 陳向東, 方呈祥, 等. 微生物學實驗[M]. 北京: 高等教育出版社, 2007: 28-24.

[16] 周德慶. 微生物學教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2010: 47-52.

[17] 孔維兵, 王曉丹, 班世棟. 醬香型大曲中酵母分離鑒定[J]. 釀酒, 2015(1): 57-62.

[18] WU Q, XU Y, CHEN L. Diversity of yeast species during fermentative process contributing to Chinese Maotai-flavour liquor making[J]. Letters of Applied Microbiology, 2012, 55(4): 301-307. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2013.07.003.

[19] TAMANG J P, FLEET G H. Yeasts diversity in fermented foods and beverages[J]. Yeast Biotechnology Diversity and Applications, 2009: 169-198. DOI:10.1007/978-1-4020-8292-4_9.

[20] 陳衛平, 涂謹, 熊建華. 紅四氮唑在酒精酵母選育中的應用效果研究[J]. 釀酒科技, 2003(6): 35-37. DOI:10.3969/ j.issn.1001-9286.2003.06.007.

[21] 中國國家標準化管理委員會. 食品中還原糖的測定: GB/T 5009.7—2008[S]. 北京: 中國標準出版社, 2006: 5-8.

[22] WANG H Y, GAO Y B, FAN Q W, et al. Characterization and comparison of microbial community of different typical Chinese liquor Daqus by PCR-DGGE[J]. Letters in Applied Microbiology, 2011, 53: 134-140.

[23] 應玲云, 伍時華, 趙東玲, 等. 燒酒曲中扣囊復膜酵母的分離及鑒定[J].食品與發酵工業, 2013(1): 146-150.

[24] 顏華. 扣囊復膜酵母(Saccharomycopsis fi buligera)代謝工程的研究[D].北京: 中國科學院微生物研究所, 2007.

[25] 孫瑩, 季方, 周維軍, 等. Biolog微生物自動鑒定系統對2 株大曲菌種的鑒定[J]. 釀酒, 2013, 40(3): 69-71. DOI:10.3969/ j.issn.1002-8110.2013.03.022.

[26] 牟含. 川南白酒釀造環境中葡萄酒增香釀造酵母菌株的篩選[D].楊凌: 西北農林科技大學, 2015.

[27] 王會會. 煙臺干紅葡萄酒發酵過程酵母菌群的研究[D]. 濟南: 山東輕工業學院, 2011. DOI:10.7666/d.d146560.

[28] 張霞. 肉鴨消化道酵母益生菌的分離和鑒定[D]. 武漢: 武漢輕工大學, 2015.

[29] 劉振興, 周結珊, 馬艷平, 等. 益生菌和有機硒對日本鰻鱺生長性能、抗氧化水平及溶菌酶活力的影響[J]. 安徽農業科學, 2015, 43(18): 156-158. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2015.18.056.

[30] FELL J W, BUCK J D. Rhodosporidium fluviale sp. nov. a homokaryotic red yeast from a subtropical brackish environment[J]. Mycologia, 1988, 80(4): 560-564.

[31] BOVO B, ANDRIGHETTO C, CARLOT M, et al. Yeast population dynamics during pilot-scale storage of grape marcs for the production of Grappa, a traditional Italian alcoholic beverage[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 129(3): 221-228. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2008.11.025.

[32] 姜楠, 張德法, 嚴冰, 等. 條件致病真菌新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)致病性研究進展[J]. 微生物學報, 2009, 49(4): 423-428. DOI:10.3321/j.issn:0001-6209.2009.04.003.

[33] KHAN A A, JABEEN M, ALANAZI A, et al. Antifungal efficacy of amphotericin B encapsulated fibrin microsphere for treating Cryptococcus neoformans infection in Swiss albino mice[J]. Brazilian Journal of Infectious Diseases An Off i cial Publication of the Brazilian Society of Infectious Diseases, 2016, 20(4): 342-348. DOI:10.1016/ j.bjid.2016.04.006.

Separation, Identif i cation and Functional Characterization of Yeast Strains from Moutai-Flavor Daqu, a Traditional Chinese Liquor Fermentation Starter

WANG Xiaodan1,2,3, CHEN Meizhu1,2, BAN Shidong1,3, QIU Shuyi1,3,*
(1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. College of Life Sciences, Guizhou University, Guizhou 550025, China; 3. School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guizhou 550025, China)

The yeasts in Moutai-flavor Daqu were counted and screened. Through morphological characteristics, physiological and biochemical tests, yeast 26S rDNA and molecular biology, we identified and classified the isolated yeasts. In addition, the fl avor compounds produced by the yeast strains in solid-state fermentation and their fermentation performance were also analyzed. The results showed that the number of yeasts in Moutai-f l avor Daqu was 103CFU/g. The yeasts isolated were classif i ed into 6 species. All the yeast strains showed different aroma-producing abilities. Among them, the solid-state fermented products of FBKL2.0071 (Saccharomycopsis fi buligera) smelled like full-bodied fruity fragrance, and the main volatile fl avor compounds included ethyl acetate, isoamyl acetate, phenylethyl alcohol, phenyl ethyl acetate and ethyl palmitate. Moreover, the solid-state fermented products of FBKL2.0082 (Hyphopichia burtonii) smelled like fullbodied fl owery fragrance, and the major volatile fl avor components, included ethyl acetate, isoamyl acetate and phenylethyl alcohol. These two strains not only could produce a large amount of alcohols and esters, but also produce small amounts of aldehydes and ketones. Besides, all the yeast strains showed different and poor ethyl alcohol-producing abilities.

Moutai-f l avor Daqu; yeast; fl avor composition; alcohol-producing ability

10.7506/spkx1002-6630-201704009

TS261.1

A

1002-6630（2017）04-0051-07

王曉丹, 陳美竹, 班世棟, 等. 茅臺大曲中酵母的分離、鑒定及其功能初探[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 51-57.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704009. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaodan, CHEN Meizhu, BAN Shidong, et al. Separation, identif i cation and functional characterization of yeast strains from Moutai-f l avor Daqu, a traditional Chinese liquor fermentation starter[J]. Food Science, 2017, 38(4): 51-57. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704009. http://www.spkx.net.cn

2016-04-16

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAC06B12）；貴州省科技支撐計劃項目（黔科合支撐[2016]2340）；貴州省科技廳重大專項（黔科合重大專項字[2013]6009號）；貴州省省校合作計劃項目（黔科合LH字[2014]7672）

王曉丹（1980—），女，實驗師，博士研究生，研究方向為應用生物技術。E-mail：wangxiaodan0516@126.com

*通信作者：邱樹毅（1963—），男，教授，博士，研究方向為發酵工程。E-mail：syqiu@gzu.edu.cn