廣藿香內生真菌類群分析及其抗菌活性研究

王營+李浩華+譚國慧+李賽妮+嚴明理+章衛民

[摘要] 從廣藿香的根、莖、葉中共分離得到72株內生真菌，根據ITS序列分析鑒定為25屬40個種，其中擬莖點霉屬Phomopsis、刺盤孢屬Colletotrichum、鐮刀菌屬Fusarium為優勢種群；廣藿香內生真菌的分布存在明顯的組織特異性，以莖中內生真菌的分布最多，占分離菌株總數的78%；活性測試結果顯示共有15個屬34株內生真菌至少對1種供試菌具有抗菌活性。結果表明廣藿香內生真菌多樣性豐富，部分菌株具有明顯的抑菌活性，值得進一步深入研究。

[關鍵詞] 內生真菌； 多樣性； 廣藿香； 抗菌活性

[Abstract] Seventy-two strains of endophytic fungi were isolated from roots， stems and leaves of Pogostemon cablin and identified as 40 species of 25 genera based on ITS sequences analysis. Among them， Phomopsis， Colletotrichum and Fusarium were dominant genera. Distribution of endophytic fungi in P. cablin showed obvious tissue-specificity， and more strains were isolated from stems with an isolation rate of 78%. The bioassay results indicated that 34 strains of 15 genera displayed antimicrobial activities against at least one of test bacteria or plant pathogenic fungi. The results obtained in this study showed that endophytic fungi in P. cablin were rich in species diversity， and some strains exhibited strong antimicrobial activities， which deserve further research.

[Key words] endophytic fungi； diversity； Pogostemon cablin； antimicrobial activity

植物內生真菌是指生長在植物體的根、莖、葉及果實等組織和器官內的一類真菌，是植物微生態系統中的重要組成成分，在進化過程中與宿主植物形成了互惠共生的關系[1]。內生真菌不但能產生結構豐富多樣的次生代謝產物，已從中分離出多種生物活性物質，包括抗菌、抗腫瘤、抗氧化等天然化合物[2-3]，而且對植物的生長發育、活性成分的積累及植物抗逆性具有重要影響[4]。藥用植物中同樣存在著大量的內生真菌[5]，中藥成分的形成、種植、抗病性及道地性可能都與內生菌有密切的關系[6]，因此，研究藥用植物內生真菌資源的多樣性不僅可以豐富真菌資源寶庫，而且對于中藥資源的保護和可持續利用具有重要的意義。

廣藿香Pogostemon cablin （Blanco） Benth.為唇形科Lamiaceae刺蕊草屬Pogostemon Desf.植物，是十大廣藥之一，其入藥最早記載于唐代《新修本草》和《千金翼方》中，自宋、金、元以來已廣泛應用于臨床。它具有芳香化濁、和中止嘔以及發表解暑的功能，用于胸悶不舒、寒濕閉暑、腹痛吐瀉、鼻淵頭痛的治療[7]。現代藥理學研究表明，廣藿香具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲等作用[8-11]。目前，對廣藿香內生真菌的研究鮮有報道，為了探討廣藿香內生真菌的多樣性、群落組成及其分布特征，本研究對其內生真菌進行了系統的分離和鑒定，并對分離得到的菌株發酵粗提物進行抗菌活性研究，旨在篩選出具有良好抗菌活性的菌株，為廣藿香內生真菌的資源保護和開發利用提供基礎資料和科學依據。

1 材料

1.1 儀器與試劑 RE-2000型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺，上海恒益科技有限公司；YXQ-WY21-600電熱高壓蒸汽滅菌鍋，廣州市華南醫療器械有限公司；THZ-C-1搖床，廣州市正一科技有限公司；Mastercycler gradient5331 PCR儀，Eppendof公司；EPS 3501電泳儀，Amersham Pharmacia Biotech公司。氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、二甲基亞砜（DMSO），均購自Sigma公司；Taq酶、DNA提取試劑盒，均購自大連寶生物工程有限公司；乙酸乙酯，廣州化學試劑廠。

1.2 植物與內生真菌 廣藿香植物于2012年10月采自廣東陽春市馬水鎮，由廣東藥科大學中藥學院嚴寒靜副教授鑒定為P. cablin。內生真菌分離自健康的廣藿香根、莖、葉。植物標本和分離菌株保存于廣東省微生物研究所。

1.3 供試指示菌 細菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、大腸桿菌（Escherichia coli，EC）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BS）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）。植物病原真菌：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides，CG）、荔枝霜疫霉（Peronophthora litchic，PL）、鏈格孢（Alternaria alternata，AA）、柱枝雙孢霉（Cylindrocladium scoparium，CS）、新月彎孢霉（Curvularia lunata，CL）。所有菌株均保存于廣東省微生物研究所。

1.4 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，Vit B1 10 mg，瓊脂20 g，蒸餾水1 L；察氏瓊脂（CDA）培養基：NaNO3 3 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O4 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4 0.01 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g；營養瓊脂培養基：蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L。

2 方法

2.1 內生真菌的分離 取新鮮的廣藿香根、莖、葉，用自來水沖洗干凈，置于濾紙上自然晾干，放入0.1%的升汞溶液中浸泡5～7 min后用無菌水漂洗4次，再放入75%的乙醇溶液中浸泡3～5 min后用無菌水漂洗3次。葉片用無菌剪刀剪去邊緣后，剪成約0.5 cm×0.5 cm的方塊；根和莖用剪刀剪掉頭尾部分，將中間部位剪成約1 cm長的小段。將上述組織塊分別置于PDA和CDA培養基（含20 mg·L-1硫酸卡那霉素和20 mg·L-1氨芐青霉素）中，同時將上述經表面滅菌后不做任何處理的材料直接接種于對應培養基中作消毒效果檢測，26 ℃恒溫培養3～7 d后挑取形態不同菌落轉接到新鮮培養基上，純化后轉接至斜面培養基中，4 ℃冰箱保存備用。

2.2 菌株的分子鑒定 將分離所得的內生真菌按常規方法用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，作為PCR擴增的模板。PCR擴增采用真菌rDNA內轉錄間隔區（rDNA ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向）擴增分離菌株的rDNA ITS區。PCR采用20 μL 反應體系，通過Ex Taq（TaKa-Ra）進行。反應條件：93 ℃預變性3 min；93 ℃變性45 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。獲得的序列通過BLAST程序在GenBank上進行相似性序列檢索分析，對分離菌株進行鑒定。

2.3 內生真菌的液體培養及粗提物制備 挑取經活化的內生真菌菌絲體接種于PD液體培養基中，28 ℃，120 r·min-1搖床培養7 d，過濾，收集發酵液并用乙酸乙酯萃取3次，萃取液于旋轉蒸發儀濃縮至干，得提取物浸膏。將提取物浸膏用DMSO溶解配制成50 g·L-1，備用。

2.4 抗細菌活性測定 將各供試細菌接種于營養瓊脂液體培養基中，37 ℃培養24 h，用無菌生理鹽水稀釋，配制成1×105～1×107 CFU·mL-1的菌液。吸取1 mL菌液于滅菌的培養皿中，倒入已冷卻到合適溫度的營養瓊脂培養基中，混合均勻，放置己滅菌的直徑為6 mm濾紙片，分別吸取提取液5 μL滴加于濾紙片上，以DMSO代替樣品提取液作空白對照，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以氨芐青霉素作陽性對照，大腸桿菌、銅綠假單胞菌以硫酸卡那霉素作陽性對照。置37 ℃恒溫箱培養16～24 h，觀察細菌生長情況并測量抑菌圈大小。

2.5 抗植物病原真菌活性測定 在含有PDA培養基的平皿中央分別接入直徑為4 mm的供試真菌菌餅，在菌餅四周均勻放置4片濾紙片，并在濾紙片上滴加5 μL提取液，以DMSO代替樣品提取液作空白對照。置28 ℃恒溫箱培養3～5 d，用十字測量法記錄菌餅生長直徑，計算抑制率。

抑制率=（1-處理組純生長量/對照組純生長量） ×100%

3 結果

3.1 內生真菌表面消毒效果 經表面滅菌后不做任何處理的廣藿香組織接種于相應的培養基中，恒溫箱中培養3～5 d后，沒有觀察到任何真菌的生長，表明經過表面消毒后的樣品，排除了其表面附生菌的影響，分離的菌株均來自植物組織內部。

3.2 內生真菌的分離鑒定 從廣藿香根、莖、葉中分離得到72株內生真菌菌株（A593-A670），經ITS序列分析鑒定為25屬40種，分離菌株中確定到種的有36株；確定到屬的有4株，分別為齒毛菌Cerrena sp. A593、多節孢Nodulisporium sp. A600、間座殼Diaporthe sp. A603、擬莖點霉Phomopsis sp. A604。菌株A641，A644與最相似物種的相似率較低，分別是95.0%，96.8%，為最相似種的參照種（表1）。

3.3 內生真菌的主要類群分析 廣藿香內生真菌的種類豐富，但各類群的數量差異較大，其中擬莖點霉屬、刺盤孢屬和鐮刀菌屬為廣藿香的優勢種群，相對頻率為12.5%，11.1%，11.1%，遠遠高于其他類群，其他類群的相對頻率均低于8.5%。

廣藿香內生真菌分布具有明顯的組織特異性。從根中分離到5株內生真菌，占分離菌株總數的7%，分屬于4個類群，包括鐮刀菌屬、莖點霉屬、曲霉屬和Acrocalymma屬；從莖中分離到56株內生真菌，占分離菌株總數的78%，分屬于20個類群，包括擬莖點霉屬、刺盤孢屬、鐮刀菌屬、棒孢菌屬、間座殼屬、小不整球殼屬、毛殼屬、彎孢屬等，從葉中分離到11株內生真菌，占分離菌株總數的15%，分屬于6個類群，包括曲霉屬、毛殼屬、彎孢屬、原毛平革屬、齒毛菌屬、黑孢屬（表2）。

3.4 抗細菌活性測定 72株內生真菌中有10個屬20株真菌提取物至少對1種供試細菌有抗菌活性（抑菌圈直徑≥8 mm），占分離菌株總數的27.8%，對2種供試細菌有抑制作用的活性菌株有14株，占分離菌株總數的19.4%。抗BS的活性菌株有18株，占分離總株數的25.0%，其中具有顯著抑制活性（抑菌圈直徑≥15 mm）的菌株有8株，分別是A593，A625，A611，A661，A654，A640，A606，A594；抗SA的活性菌株有16株，占分離總株數的22.2%，其中具有顯著抑制活性的菌株有4株，分別是A593，A625，A594，A606；抗EC的活性菌株有2株，分別是A611，A625。所有內生真菌的提取物對銅綠假單胞菌均沒有抑制作用（表3）。

3.5 抗植物病原真菌活性測定 72株內生真菌中共有14個屬31株真菌提取物至少對1種供試病原真菌有抑制作用（抑制率≥50%以上），占分離菌株總數的43.1%，其中對所有供試病原真菌都有抑制作用的菌株有4株，分別是A607，A633，A643，A663；抗PL活性顯著（抑制率≥95%以上）的菌株有6株，分別是A593，A625，A654，A616，A661，A663；抗CL，CS活性顯著（抑制率≥80%以上）的菌株分別有2株，1株，分別是A607，A643，A633（表4）。

4 討論

本研究從廣藿香根、莖、葉中分離獲得72株內生真菌，經ITS序列分析鑒定為25個屬40個分類單元，其中擬莖點霉屬、刺盤孢屬和鐮刀菌屬為優勢菌群，而且這些內生真菌在廣藿香不同組織中的分布存在明顯的組織特異性，其中莖中內生真菌類群最為豐富，葉和根中分離的內生真菌類群較少。通過活性測試發現廣藿香內生真菌擬莖點霉、鐮刀菌、曲霉菌具有顯著的抗菌活性，為進一步發掘活性次級代謝產物提供了理論依據。

擬點莖霉是常見的植物內生真菌，能產生多種活性代謝產物。Wagenaar等[12]從薄荷Mentha haplocalyx中分離到的擬莖點霉屬內生真菌能產生一種具有臨床應用前景的新抗生素dicerandorls；Silva等[13]從美麗決明Cassia spectabilis的內生真菌P. cassiae發酵液中得到的杜松烷倍半萜類化合物3，11，12-trihydroxycadalene對球孢枝孢Cladosporium sphaerospermum和枝狀枝孢C. cladosporioides具有明顯的抑制活性。鐮刀菌也是常見的植物內生真菌，該屬內生真菌產生的代謝產物對病原菌具有抑制作用。如邵志宇等[14]從互花米草Spartina alterniflora內生真菌Fusarium sp. F4中分離得到的白僵菌素Ⅲ對結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis的MIC為5 mg·L-1；劉兆迪等[15]從藥用植物三尖杉Cephalotaxus fortunei中分離得到的內生真菌F. tricinctum對B. subtilis，E. coli，Salmonella typhl具有明顯的抑制作用。曲霉是分離頻率很高的一類內生真菌，能產生具有抗菌活性的代謝產物。Liu等[16]從狗牙根Cynodon dactylon內生真菌A. fumigatus中分離到的asperfumid具有抗白色念珠菌活性，其MIC為75 μg·L-1；周鳳等[16]從黃芪內生真菌Aspergillus sp.中分離到的cyclotryprostatins B對B. subtilis，E.coli的MIC值均為1 mg·L-1。

植物內生真菌不但可以產生重要的活性次級代謝產物，而且還能對藥用植物揮發油成分產生重要影響。研究表明，亞洲薄荷中的2種內生真菌對薄荷揮發油中的桉油素和氧化胡椒烯酮含量能產生顯著性影響[17]，蒼術中的3種內生真菌能改變蒼術揮發油中4種主要活性成分蒼術酮、蒼術醇、β-桉葉醇及蒼術素的相對百分含量[18]。本研究分離獲得的內生真菌還將為進一步開展廣藿香植物內生真菌與其揮發油中成分的相關性研究奠定了基礎。

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