多穗柯轉錄組分析及黃酮類化合物合成相關基因的挖掘

宋菊+黃劍+李志棟+龍月紅+邢朝斌

[摘要] 多穗柯具有甜味和保健功效，其中黃酮類化物是主要活性物質。為獲取多穗柯轉錄組數據庫以及黃酮類化合物生物合成相關基因，該研究用RNA-Seq中的Illumina HiSeq 4000對多穗柯嫩葉進行轉錄組測序，共獲得6 Gb數據，拼接后得到41 043條Unigene，與7個基因數據庫進行比對，可歸類于51個GO分類中，涉及到237個KEGG標準代謝通路。找到黃酮合成相關基因28條。通過MicroSatallite（MISA）軟件分析篩選到18 161個SSR，其中單堿基重復最豐富，有7 346個。此研究得到大量轉錄本信息，為多穗柯的分子生物學研究提供了寶貴的轉錄組數據庫資源。

[關鍵詞] 多穗柯； 轉錄組； 高通量測序； 黃酮類化合物

[Abstract] The sweet taste and health effect of Lithocarpus polystachyus are mainly related flavonoid. To obtain Lithocarpus transcriptome database and flavonoid biosynthesis-related genes， the RNA-Seq techology （Illumina HiSeq 4000） was used to sequence its transcriptome. Six Gb database was assembled after assembly steps， and 41 043 of L. polystachyus unigenes were obtained. With blasting them with 7 data banks， all unigenes were involved in 51 GO-terms and 237 metabolic pathways. And furthermore 28 genes of the flavonoid biosynthesis-related were found. After using the MicroSatallite， 18 161 SSR were obtained， the single-nucleotide-repeated was the richest at 7 346. These data represent abundant messages about transcripts and provide valuable genome data sources in molecular biology of L. polystachyus.

[Key words] Lithocarpus polystachyus； transcriptome； high-throughput sequencing； flavonoids

多穗柯Lithocarpus polystachyrus Rehd，別名甜茶，是殼斗科石柯屬常綠喬木[1]。因其具有強烈的甜味和保健功能而被廣泛關注，其中二氫查耳酮類化合物根皮苷和三葉苷是其主要活性物質，具有降血糖、保肝、抗氧化、抗腫瘤等生物活性[2]。三葉苷的含量在多穗柯二氫查二酮苷類中最高，占95%，且根皮苷和三葉苷互為異構體。目前，僅有根皮苷受到較高關注，它的合成途徑[3]、作用[4]等都已有相關報道，但是關于多穗柯中根皮苷和三葉苷的合成、代謝以及它們相互轉化的途徑尚不夠明確。因此，利用轉錄組測序技術，對多穗柯轉錄組進行分析，找出黃酮類化合物合成相關基因，為后續對根皮苷和三葉苷的研究提供資源。

轉錄組是指特定生物體在某種狀態下所有基因轉錄產物的總和，轉錄組研究屬于功能基因組學研究的范疇，是連接基因組與蛋白質組的紐帶[5]。它能反映生物個體在特定器官、組織或某一特定發育、生理階段細胞中所有基因表達水平的數據?？捎脕肀容^不同組織或生理狀況下基因表達水平差異，發現與特定生理功能相關的基因，推測未知基因[6]。因此，采用轉錄組測序技術，對多穗柯轉錄組進行測序分析，建立起轉錄組數據庫，為多穗柯中黃酮類化合物二氫查耳酮類的根皮苷和三葉苷生物合成研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 cDNA制備

以多穗柯嫩葉為本研究原材料提取植物總RNA，再逆轉錄為cDNA，用于構建轉錄組數據庫。植物總RNA 提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 轉錄組數據的組裝與分析

1.2.1 組裝 采用Illumina HiSeq 4000測序技術平臺的PE150技術進行測序，將得到的Raw Data進行過濾處理，獲得高質量的Clean Reads，使用trinity軟件進行組裝，得到Unigene。

1.2.2 功能預測 利用BlastX將All-Unigene與nr[7]，Swiss-Prot[8]，GO[9]，KOG[10]，KEGG[11]等6個數據庫進行比對。又使用KOBAS2.0[12]去獲取序列在KEGG中比對KEGG Orthology結果，預測出序列的氨基酸序列之后，使用HMMER[13]軟件與Pfam[14]數據庫比對，獲得注釋信息。

1.2.3 黃酮類化合物合成相關基因的挖掘 根據康亞蘭[15]和郭欣慰[16]提出的黃酮類化合物合成途徑中的結構基因與調節基因，以及KEGG注釋的結果和數據庫中已知的基因信息，利用本地Blast進行檢索比對，確定本轉錄組數據中與黃酮合成相關的基因。

1.2.4 SSR分析 微衛星序列（microsatellite DNA）又稱為簡單序列重復（simple sequence repeats，SSR） 或簡單序列（simple sequences），是指以1～6個核苷酸為基本重復單位的串聯重復序列，其長度大多在 100 bp 以內。它們廣泛存在于各類真核生物基因組中，原核生物基因組中也含有少量的微衛星序列[17]。SSR作為分子標記的一種，被廣發用于雜交育種、種群遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜的構建等研究領域。目前關于多穗柯的分子標記十分有限，本研究利用MicroSatallite（MISA）軟件找出全部的SSR，為多穗柯的遺傳標記研究提供非常重要物質資源和依據。

2 結果與分析

2.1 組裝

總共得到6 Gb的Clean Date，組裝獲得Unigene 41 043條，N50長度為1 472 bp，長度大于N50的Unigene 有8 977條，組裝完整性較高，具體組裝結果見表1。

通過BlastX與nr數據庫進行比對，有28 970 條Unigene獲得注釋，從匹配的物種來源分析，有10.91%的Unigene注釋到葡萄中，8.51%注釋到可可中，其余分別為梅花8.19%、桃6.51%、白僵菌5.38%、麻風樹4.85%、桑樹4.24%、蓖麻4.12%、野草莓4.05%，橙子3.39%，其余39.85%注釋到其他物種中，見圖1。

隨后將所有的Unigene比對到KOG數據庫中，結果顯示有15 957條序列獲得17 067個注釋信息，劃分為25個功能分類。從基因功能分布特征中可以發現一般功能預測基因分布最多，多達3 751條，涉及翻譯后修飾、蛋白翻轉、分子伴侶功能的基因次之，有1 736條，而涉及核結構、胞外結構和細胞運動的基因很少，僅有59條、56條和5條。此物種的KOG功能注釋分布結構與其他物種不盡相同，見圖2。

A.RNA加工和修飾；B.染色體結構和動力學；C.能源產生和轉化；D.細胞周期調控，細胞分裂，染色體分離；E.氨基酸轉運和代謝；F.核算轉運和代謝；G.碳水化合物轉運和代謝；H.輔酶轉運和代謝；I.脂類轉運和代謝；J.翻譯，核糖體結構和生源；K.轉錄；L.復制，重組，修飾；M.細胞壁，細胞膜，被膜生源；N.細胞活性；O.翻譯后修飾，蛋白反轉，伴侶；P.無機離子；Q.次生代謝物的生物合成，轉運和代謝；R.一般功能預測；S.未知功能；T.信號傳遞機制；U.細胞內運輸，分泌和囊泡轉運；V.防御機制；W.細胞外結果；Y.核結構；Z細胞骨架。

通過使用Blast2GO與GO數據庫的比對，21 777條Unigene獲注釋信息，在利用WEGO對注釋信息進行分類統計，得到136 004個GO功能注釋。由分類結果可知：生物學過程最多60 216條，占44.27%，其次是細胞組分，49 219條，占36.19%，最后是分子功能，26 569條，占19.54%。這三大功能分類又可分為51個亞類，其中生物學過程19個亞類，細胞組分15個亞類，分子功能17個亞類。生物學過程中，涉及代謝過程、細胞過程和單一有機體進程的Unigene較多，分別有14 761，12 924，10 871條；細胞組分中涉及較多的是細胞、細胞部分和膜類，分別有10 018，9 976，8 784條；分子功能中涉及較多的有催化活性和結合功能，分別有11 902，10 544條。與其他物種的表達豐度基本一致。具體種類和數量見圖3。

將Unigene 與KEGG比對，進行Pathway注釋，獲得基因產物在細胞的代謝途徑以及這些基因產物的功能。比對結果顯示有9 648條序列得到9 325個注釋，共涉及到237個KEGG標準代謝通路。按基因獲得注釋量的多少進行排序，選取前10個見表3，涉及碳代謝的Unigene數量最多有392條，占4.20%，其次是與氨基酸的生物合成相關的Unigene，有343條，占3.68%，其余主要富集于核糖體、嘌呤代謝、糖酵解和糖異生等代謝途徑。

通過在數據庫中查找已有的基因信息和本地Blast比對，共找出黃酮合成相關基因28條，結構基因21條，調節基因7條，見表4。根據蘋果[3]中根皮苷的合成途徑可知，苯丙氨酸經過苯丙氨酸解氨酶（47968_c1_g1）、肉桂酸羥化酶（46682_c0_g1）、4香豆酰CoA連接酶（42305_c0_g1）的催化，生成香豆酰CoA；乙酰CoA被乙酰CoA羧化酶羧化而成丙二酸單酰CoA。二者經查耳酮合成酶（43222_c0_g1）催化縮合而成查耳酮，緊接著被糖基轉移酶（38697_c0_g1）糖基化而成根皮苷。

本研究利用MicroSatallite（MISA）軟件找出全部的SSR，總計18 161個，其中單堿基型重復最為豐富，有7 346個，占總量40.45%，在這之中A/T類型分布占其96.31%。其次是雙堿基型重復，6 618個，占總量36.44%，其中AG/CT類型分布占其總量78.57%。其他類型依次為：三堿基型重復，3 843個，占21.16%；四堿基型重復，191個，占1.05%；五堿基型重復，66個，占0.36%；最后是六堿基型重復，97個，占0.53%，見圖4。通過對多穗柯SSR的研究，將為多穗柯的遺傳標記研究提供非常重要物質資源和依據。

3 討論

近年來，隨著多穗柯的甜味和保健作用，尤其是降糖作用被發現，市場需求逐漸變大，研究工作也不斷的深入。為更好地探索多穗柯中黃酮類化合物合成，本研究采用RNA-seq技術，獲得6 Gb多穗柯轉錄組數據，經過拼接組裝得到41 043條Unigene，N50的長度為1 472 bp，相對于其他已測序的物種，如油松的N50是744 bp[18]；芝麻的是1 006 bp[19]，組裝效果好，完整性高。

通過與7個數據庫比對，總共有30 223條Unigene獲得注釋信息。根據KEGG pathway分析和已知的基因信息，找出28條黃酮合成相關基因，不僅有CHS（查耳酮合成酶）、CHI（查耳酮異構酶）、IFS（異黃酮合成酶）等關鍵酶基因，還有一些比較重要的基因，如PAL（苯丙氨酸解氨酶）基因、AAC（乙酰輔酶A羧化酶）基因、ANS（花青素苷合成酶）基因，與草麻黃[20]轉錄組中發現的黃酮合成相關基因大部分一致。通過轉錄組的組裝分析以及黃酮合成相關基因的挖掘，為后續對多穗柯的研究奠定了基礎。

[參考文獻]

[1] 何春年， 彭勇， 肖偉， 等. 多穗柯甜茶的研究進展[J]. 時珍國醫國藥， 2012， 23（5）： 1253.

[2] 周瑤， 李偉， 曲欣楠， 等. 天然二氫查耳酮類化合物分布及生物活性研究進展[J]. 中國野生植物資源， 2014， 33（6）： 35.

[3] Gosch C， Halbwirth H， Stich K. Phloridzin： biosynthesis， distribution and physiological relevance in plants[J]. Phytochemistry， 2010， 71（8/9）： 838.

[4] 譚飔， 周志欽. 根皮苷研究進展[J]. 食品與發酵工業， 2013， 39（8）：182.

[5] 張召寶， 侯林， 潘晴， 等. 中草藥高通量轉錄組研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（9）： 1553.

[6] 吳瓊， 孫超， 陳士林， 等. 轉錄組學在藥用植物中的研究應用[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化， 2010， 12（3）： 457.

[7] Deng Y Y， Li J Q， Wu S F， et al. Integrated nr database in protein annotation system and its localization[J]. Comput Eng， 2006， 32（5）： 71.

[8] Apweiler R， Bairoch A， Wu C H， et al. UniProt： the universal protein knowledge base[J]. Nucleic Acids Res， 2004， 32（1）：115.

[9] Ashbuener M， Ball C A， Blake J A， et al. Gene ontology： tool for the unification of biology[J]. Nat Genet， 2000， 25（1）： 25.

[10] Koonin E V， Fedorova N D， Jackson J D， et al. A comprehensive evolutionary classification of proteins encoded in complete eukaryotic genomes[J]. Genome Biol， 2004， 5（2）： R7.

[11] Kanehisa M， Goto S， Kawashima S， et al. The KEGG resource for deciphering the genome[J]. Nucleic Acids Res， 2004， 31（1）： 277.

[12] Xie C， Mao X， Huang J， et al. KOBAS 2.0： a web server for annotation and identification of enriched pathways and diseases[J]. Nucleic Acids Res， 2001， 39（2）： 316.

[13] Eddy S R. Profile hidden Markov models[J]. Bioinformatics， 1998， 14（9）： 755.

[14] Finn D R， Bateman A， Clements J， et al. Pfam： the protein families database[J]. Nucleic Acids Res， 2014，42 （Database issue）：222.

[15] 康亞蘭， 裴瑾， 蔡文龍， 等. 藥用植物黃酮類化合物代謝合成途徑及相關功能基因的研究進展[J]. 中草藥， 2014， 45（9）： 1336.

[16] 郭欣慰， 黃叢林， 吳忠義， 等. 植物類黃酮生物合成的分子調控[J]. 北方園藝， 2011（4）： 204.

[17] 羅文永， 胡駿， 李曉方. 微衛星序列及其應用[J]. 遺傳， 2003， 25（5）： 615.

[18] Niu S H， Li Z X， Yuan H W， et al. Transcriptome characterisation of Pinus tabuliformis and evolution of genes in the Pinus phyloheny[J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 167.

[19] 魏利斌， 苗紅梅， 張海洋. 芝麻發育轉錄組分析[J]. 中國農業科學， 2012， 45（7）： 1246.

[20] 馬婧， 成鐵龍， 孫燦岳， 等. 草麻黃高通量轉錄組分析及黃酮類代謝途徑相關基因的鑒定[J]. 浙江農業學報， 2016， 28（4）： 609.