基于代謝組學的麻黃細辛附子湯治療流感小鼠的作用機制研究

孫啟慧+張靜+李壯壯+杜寶香+蔣海強+楊勇+呂青濤+容蓉

[摘要] 該研究運用代謝組學方法，研究麻黃細辛附子湯（MXF）干預的流感小鼠血清中內源性代謝物的變化，尋找潛在生物標志物及相關的代謝通路，探討MXF的藥效及作用機制。實驗選用昆明（KM）小鼠36只，隨機分為正常組、流感組、MXF組，使用流感病毒H1N1滴鼻感染，建立流感小鼠模型；MXF組使用藥物干預，其他組給予等體積的生理鹽水，每日1次，連續6 d，記錄小鼠的體重、肛溫等藥理指標，末次給藥24 h后收集血清樣本，采用HPLC-TOF-MS檢測。結果顯示，與正常組相比，流感組小鼠體重、肛溫均出現不同程度下降，肺指數和死亡率明顯升高（P<0.05），MXF組各藥理指標出現良好的回調趨勢；血清樣本采集的原始數據，使用R語言，MPP，SIMCA-P等軟件進行處理，發現3組小鼠血清中14種內源性物質發生顯著性變化（P<0.05），經MXF干預后代謝物水平均出現不同程度的回調；進一步利用MetPA數據平臺分析發現，14種代謝物涉及的通路包括糖代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂和鞘脂代謝等。通過對這些差異性代謝物生理功能的分析，并結合測定的宏觀藥理指標的分析，推測MXF可能從改善糖代謝，調節花生四烯酸代謝、甘油磷脂和鞘脂代謝等多途徑，發揮其藥效作用。

[關鍵詞] 代謝組學； 流感小鼠模型； 麻黃細辛附子湯； 潛在生物標志物

[Abstract] This study aimed to analyze the endogenous metabolite changes in the serum of mice infected with H1N1 virus after intervention by Mahuang-Xixin-Fuzi decoction （MXF） based on metabolomics method， investigate potential biomarkers and related metabolic pathways， and explore the therapeutic mechanism of MXF through metabolomics technology. Thirty-six Kunming （KM） mice were randomly divided into three groups： normal group， model group and MXF group. Influenza virus H1N1 was used by nasal drip to establish influenza mice model. The mice in MXF group were orally administrated with MXF for 6 consecutive days after inoculation， and the other two groups were given with equal volume of saline solution in the same way. Body weight， rectal temperature， morbidity and mortality were recorded daily. Serum samples were collected 24 hours after the last administration for HPLC-TOF-MS analysis. The results showed that as compared with the normal group， the body weight and rectal temperature were decreased in model group， and their lung index and mortality rate were significantly increased （P<0.05）； MXF had good therapeutic effects on the abnormity of body weight， rectal temperature， lung index and high mortality rate of mice infected with H1N1 virus. The original data collected from the serum samples were analyzed with R language， MPP， SIMCA-P and other software， and significant changes were found in 14 kinds of endogenous substances from mice serum （P<0.05）. As compared with model group， the potential metabolic markers in MXF group recovered to normal levels to a certain degree after being intervened by MXF. Further analysis with MetPA data platform showed that， the pathways involved in 14 metabolites included glucose metabolism， arachidonic acid metabolism， glycerophospholipids and sphingolipids metabolism etc. The metabolomics study and pharmacological experiment showed that MXF might play a role of efficacy by improving glucose metabolism， regulating arachidonic acid metabolism， glycerophospholipid and sphingolipid metabolic pathways.

[Key words] metabolomics； mice model infected with influenza virus A； Mahuang Xixin Fuzi decoction； potential metabolic markers

代謝組學（metabolomics）是現代系統生物學研究的一個重要方面，于20世紀90年代末期迅速發展起來；主要通過對組群的指標進行分析，對生物體在遺傳變異、疾病侵襲、藥物干預等內外因素的作用下，其中所包含的內源性小分子代謝物（一般是指相對分子質量小于1 000的物質）種類和數目等變化的動態規律以及與生理、病理變化的關聯，進行定性定量分析[1-3]。該方法與中醫藥學的整體觀念相結合，為研究中醫證候本質以及中藥的整體作用機制提供新的思路和方法[4]。

流感是一種呼吸道傳染病，流行性強，波及范圍極廣，據統計每年全球大約有20%的人感染流感，其中2009年爆發的全球性H1N1甲型流感造成全球至少20萬人死亡[5]。流感臨床癥狀較重，具有發病急驟的特點，感染流感后會出現畏寒、發熱、頭痛、全身無力等癥狀，有時會同時出現咽喉疼痛、咳嗽等呼吸道方面的癥狀；另外流感容易出現并發癥，嚴重時可引起患者的死亡[6-7]。“麻黃細辛附子湯”（Mahuang-Xixin-Fuzi decoction， MXF）來源于東漢時期著名醫家張仲景《傷寒論》，該方組方嚴謹，作為經典方劑在臨床中應用廣泛，后世常用MXF及其加減方劑治療各種疾病，主要是以溫經散寒解表，表里兼治為功用[8-9]。本研究通過比較流感小鼠和MXF干預的流感小鼠血清內源性代謝物變化，擬探究中藥復方治療疾病的方證相關性，以及藥物的干預作用，為闡釋流感小鼠的生物學本質及MXF對其干預作用機制研究提供依據。

1 材料

Agilent 1260系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，配有在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱）；Agilent 6230 TOF質譜儀（美國安捷倫公司，配有標準的電噴霧離子源、Mass Hunter Data Acquisition在線工作站和Qualiative Analysis離線分析軟件）；智能恒溫控制儀（成都泰盟科技有限公司）；ZIL-2 型小鼠自主活動儀（中國醫學科學院藥物研究所）；01193-YP601N 型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；DW-HL668超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責任公司）；3K15通用臺式冷凍離心機（德國Sigma公司）；高速離心機（上海醫用分析儀器四廠，編號3741）；渦旋儀（Benchmark Scientific Inc.，編號12081354）；乙腈（高效液相色譜純，Tedia， USA）；甲酸（高效液相色譜純，Tedia， USA）。

流感病毒H1N1（北京地方株，引自中國 CDC 病毒病研究所）；麻黃、附子、細辛（批號20110501，均購自濟南市建聯中藥有限公司中藥飲片廠），經山東中醫藥大學李峰教授鑒定，分別為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf. 的干燥草質莖，毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx. 的炮制品，馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.） Kitag. 的干燥根和根莖，均符合《中國藥典》2015年版標準。

KM小鼠，體重（20±2） g，SPF級，由山東魯抗動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK（魯） 20080002。

2 方法

2.1 流感小鼠模型的制備

KM小鼠按照體重和肛溫隨機分成正常組、流感組和MXF組，使用流感病毒H1N1雞胚尿囊液（血凝滴度為1∶320）滴鼻感染小鼠（50 μL/只），正常組小鼠滴鼻接種等量的生理鹽水[10]；第1 天接種流感病毒，第2～7天為藥物干預治療，每天記錄小鼠體重、肛溫變化，觀察小鼠的精神狀態、發病及死亡情況。

2.2 給藥劑量設計

小鼠給藥量按10 mL·kg-1計算，MXF劑量為2.5 g·kg-1·d-1，相當于人臨床等效劑量；于感染第2天給藥干預，正常組和流感組灌服等體積的蒸餾水，連續給藥6 d，每天1次。

2.3 指標觀察

造模過程中每天測量接種流感病毒后小鼠的肛溫、體重1次，記錄每天變化趨勢，連續7 d；觀察過程中小鼠的臨床癥狀如精神狀況、活動度、飲食等變化；計算每組的死亡率：死亡率=死亡動物數/動物總數×100%；實驗結束取各組小鼠肺、脾、胸腺等組織，稱取臟器質量，計算臟器指數。

2.4 血清樣品前處理

精密吸取所處理的正常和模型組樣品各200 μL，分別用3倍量乙腈進行沉淀，渦旋5 min，1萬 r·min-1高速離心15 min，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，作為樣品溶液。

2.5 色譜和質譜條件

HALO C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～15 min，15%B，15～20 min，15%～55%B，20～30 min，55%～75%B，30～40 min，75%～95%B，40～45 min，95%～100%B，45～65 min，100%B，流速0.3 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量5 μL。質譜采集選擇正離子模式；毛細管電壓140 V；質量數掃描范圍100～1 000；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速8 L·min-1；霧化壓力30 psi（1 psi=6.895 kPa）；參比離子質荷比m/z 121.050 6，922.009 8。

2.6 數據處理

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004年A版）》，進行樣品血清代謝物的相似度評價，以便進一步進行各樣品中主要成分的分析。相似性越高，重復性越好。

2.6.1 數據采集與多維數據分析 獲得的原始數據經Agilent Mass Hunter Workstation（Qualitative Analysis B.06.00）軟件進行數據轉換，并進行去同位素峰處理。得到的數據導入R軟件使用XCMS軟件包進行峰對齊和峰積分等處理，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的三維數據矩陣，參數設定包括 fwhm=10，bw=10，snthresh=5，其余的參數全部使用默認數值，并采用修正80%規則去除缺失值。再將得到的數據導入SIMCA-P 11.5（Umetrics）處理軟件，對數據集進行數據的標度化和中心化處理，采用無監督的主成分分析（PCA）和有監督的偏最小二乘判別分析方法（ partial least square discriminant analysis，PLS-DA） 對數據進行分析，選擇投影變量重要性（variable importance for the projection，VIP）>1.5的變量，進行t檢驗，方差分析（ANOVA）以及對數轉換（fold change，FC）分析。本試驗將VIP>1.5，P<0.05，FC>1.2的代謝物作為潛在生物標志物。

2.6.2 生物標志物的鑒定及代謝途徑的分析 根據模式識別后篩選得到的潛在生物標志物的精確相對分子質量，查詢以下代謝產物和質譜數據庫：KEGG（http：//www.kegg.com），HMDB（http：//www.hmdb.ca），METLIN（http：//www.metlin.scipps.edu）進行質譜信息匹配，對潛在生物標志物進行初步鑒定。將鑒定得到的標志物導入Metpa數據庫，進行代謝通路的關聯和分析。

3 結果

3.1 體重肛溫

正常組小鼠的體重有升有降，但總體呈上升趨勢；流感組小鼠體重呈現持續下降趨勢；MXF組給藥干預第1 天體重呈降低趨勢，第2～6天體重逐漸上升，說明MXF對流感小鼠體重回升具有一定的積極作用，結果見表1。正常組小鼠的肛溫高于其他組，流感組小鼠肛溫在藥物干預的第5，6 天明顯低于正常組（P<0.01），MXF組小鼠肛溫在藥物干預后不斷上升，與正常組沒有顯著性差異，在藥物干預的第6天明顯高于流感組小鼠的肛溫（P<0.01），結果見表2。

3.2 死亡率、肺指數

死亡率和肺指數是2項重要的藥理檢測指標，結果顯示，正常組和MXF組小鼠均無死亡現象，流感組死亡率為8.3%，MXF具有明顯降低小鼠死亡率的趨勢（P<0.01）；流感組小鼠的肺指數明顯高于正常組（P<0.05），經MXF干預后流感小鼠的肺指數降低且與正常組無顯著性差異，結果見表3，圖1。

3.3 臟器指數

與正常組相比，流感組小鼠的脾指數，睪丸指數和精囊腺指數均明顯降低（P<0.05），MXF干預組小鼠的脾、胸腺、腎、精囊腺等臟器指數出現明顯回升，與正常組無顯著性差異，并且脾指數已經基本恢復至正常水平，與流感小鼠相比出現顯著性差異（P<0.05），結果見表4。

3.4 數據處理結果

3.4.1 方法學考察結果 采用《中藥色譜指紋圖和精囊腺指數均明顯降低（P<0.05），MXF干預組小鼠的脾、胸腺、腎、精囊腺等臟器指數出現明顯回升，與正常組無顯著性差異，并且脾指數已經基本恢復至正常水平，與流感小鼠相比出現顯著性差異（P<0.05），結果見表4。

3.4 數據處理結果

3.4.1 方法學考察結果 采用《中藥色譜指紋圖血清代謝組學數據的S-Plot-VIP圖，通過loading圖和S-Plot-VIP圖，可以得到不同組間差異性較大的物質，見圖6，7。圖6，7中偏離中心（原點）越遠的點，表示該物質在不同組間差異越大，即可能為不同組間潛在的生物標志物。

3.4.5 潛在生物標志物的鑒定 通過PLS-DA，t檢驗，方差分析（ANOVA）以及對數轉換分析，選取VIP>1.5，P<0.05，FC>1.2的差異性變量；根據變量的保留時間和精確質核比在HMDB，METLIN，KEGG數據庫中檢索潛在生物標志物。其中正常組和流感組中鑒定了13個潛在生物標志物；正常組、流感組和MXF組中鑒定了14個潛在生物標志物；主要涉及花生四烯酸代謝，亞油酸代謝，甘油磷脂和鞘脂代謝以及能量代謝等代謝通路，見表5，6。

3.4.6 MetPA代謝通路分析 MetPA（metabolomics pathway analysis）是基于網絡、易于使用、全功能的代謝路徑分析工具，它結合先進的通路富集分析與拓撲分析，能夠幫助研究者找出實驗結果中最可能的相關代謝通路。因此，將得到的差異性潛在標志物輸入MetPA平臺，分析正常外感模型造模后血清中差異性潛在標志物的代謝通路。很多代謝物會涉及到多條代謝通路，這就意味著代謝通路分析方法對于代謝組學實驗中的生物學解釋具有很好的優勢，結果見圖8。

4 討論

葡萄糖一直被認為是機體生命活動所依賴的主要能源物質，研究發現[14-15]，當機體過度消耗葡萄糖用于能量供應時，血周葡萄糖濃度會急劇降低，而乳酸的濃度會顯著升高，用于提供能量；流感模型組小鼠血清中，D-葡萄糖含量下降，乳酸含量升高，推測是由于感染病毒后小鼠體內病毒大量復制消耗能量所致。另外，模型組小鼠血清中苯丙氨酸的含量升高，該物質能夠促進腸道激素釋放腸促胰肽酶（CCK），從而產生飽感而抑制食欲，最終減少能量的攝入[16]；模型組小鼠日常飲食的攝入量會減少，體重降低，可能是由于小鼠血清中苯丙氨酸含量升高，食欲減弱造成。以上實驗結果顯示，H1N1感染的流感小鼠與糖代謝和氨基酸代謝關系密切；中藥MXF干預后，小鼠血清中D-葡萄糖，乳酸以及苯丙氨酸均出現不同程度的回調，推測該藥物通過調節糖代謝和氨基酸代謝途徑，起到對流感的干預作用。

炎癥是機體對組織損傷或致病因子侵入所發生的防御反應[17]，花生四烯酸在炎癥和免疫反應中起到重要的調節作用，該物質一般由油酸、亞油酸等轉化而來，主要以磷脂的形式存在于生物膜上[18]，與許多疾病的代謝有密切關系。該物質可通過環氧化酶途徑和脂氧化酶途徑代謝為前列腺素（prostaglandins，PGs）、血栓素（thromboxane，TXs） 等代謝物[19-20]。本實驗中，模型組小鼠感染H1N1，肺部炎癥明顯，肺指數明顯升高，同時研究發現模型小鼠血清中油酸，亞油酸，二十碳五烯酸以及血栓素等物質代謝異常；經中藥MXF干預后小鼠肺指數與正常組沒有顯著性差異，肺組織修復良好，并且上述物質代謝趨于正常水平，提示花生四烯酸代謝通路是MXF干預流感的作用通路之一。

H1N1病毒感染會導致呼吸道黏膜水腫和肺部炎癥反應，引起炎性介質釋放[21]，從而激活細胞膜上的磷脂酶A2，使甘油磷脂水解，產生溶血卵磷脂（LPC）、溶血腦磷脂及花生四烯酸等[22-23]，其中LPC類物質能與蛋白共同組成肺泡表面的免疫活性物質，有助于控制機體炎性反應發生和肺部感染[24]。本實驗發現，模型小鼠血清中LPC含量顯著上升，MXF治療后LPC類成分趨向正常水平。研究同時發現，流感組小鼠血清中鞘脂代謝通路的主要成分之一鞘氨醇含量顯著升高，該研究結果與Lu等[25]對感染H1N1病毒患者的血清代謝組學研究結果相符，MXF治療后鞘氨醇含量回調。從而推測MXF對H1N1病毒感染的治療作用，與干預甘油磷脂代謝和鞘脂代謝通路有密切關聯。

本研究采用基于HPLC-TOF-MS的代謝組學方法研究了H1N1感染的流感小鼠疾病模型以及中藥MXF的干預作用機制。結果顯示，采用代謝組學研究方法通過對這些差異性代謝物生理功能的分析，結合測定的宏觀藥理，推測MXF可能從改善能量代謝、調節花生四烯酸代謝和甘油磷脂代謝等多途徑，發揮其藥效作用。該方法能較全面地從生物體生理及代謝狀態的整體角度探討中藥的作用機制，為闡釋中藥藥效的本質提供了一種手段。

[參考文獻]

[1] Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. "Metabonomics" understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data [J]. Xenobiotica， 1999， 29（11）： 1181.

[2] Nicholson J K， Connelly J， Lindon J C， et al. Metabonomics： a platform for studying drug toxicity and gene function[J]. Nat Rev Drug Discov， 2002（2）： 153.

[3] 楊雯晴， 李運倫， 蔣海強. 基于高效液相色譜-質譜技術的纈沙坦作用機制的研究[J]. 藥學學報， 2015， 50（7）： 875.

[4] 賈敏，苗陽，高鑄燁.代謝組學技術在證候研究中的應用進展[J].世界中醫藥，2015，10（9）：1457.

[5] Dawood F S， Iuliano A D， Reed C， et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation： a modelling study [J]. Lancet Infect Dis， 2012， 12（9）： 687.

[6] Quandelacy T M， Viboud C， Charu V， et al. Age and sex related risk factors for influenza-associated mortality in the United States between 1997—2007 [J]. Am J Epidemiol， 2014， 179（2）： 156.

[7] 中華醫學會呼吸病學分會. 流行性感冒臨床診斷和治療指南（2004年修訂稿）[J]. 中華結核和呼吸雜志， 2005， 28（1）： 5.

[8] 檉坤. 麻黃細辛附子湯對50歲以上男性排尿的影響[J]. 國外醫學·中醫中藥分冊， 2002， 24（3）： 165.

[9] 侯一軍， 郭旸， 于書香. 麻黃細辛附子湯加味治療潰瘍性結腸炎32例[J]. 北京中醫藥， 2012， 31（3）： 201.

[10] 鄭倩倩， 謝克勤， 劉倜， 等. 人季節性 H1N1 流感病毒小鼠感染模型的建立[J]. 山東大學學報， 2012， 50（1）：147.

[11] 蔣海強， 聶磊， 李運倫， 等. 清熱降壓膠囊干預 SHR海馬區組織代謝組學研究[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（1）：134.

[12] 夏小濤， 孫寧， 秦雪梅， 等. 基于1H-NMR代謝組學的抑郁癥生物標志物發現及帕羅西汀干預作用[J]. 藥學學報， 2016， 51（4）： 595.

[13] Xu Jing， Chen Yanhua， Zhang Ruiping， et al. Global and targeted metabolomics of esophageal squamous cell carcinoma discovers potential diagnostic and therapeutic biomarkers [J]. Mol Cell Proteomics， 2013， 12（5）： 1306.

[14] 楊東升， 劉曉莉， 喬德才. 力竭運動過程中大鼠紋狀體葡萄糖/乳酸代謝的實時觀察[J]. 中國運動醫學雜志， 2009， 28（4）： 384.

[15] Kemppainen J， Aalto S， Fujimoto T， et al. High intensity exercise decreases global brain glucose uptake in humans [J]. J Physiol， 2005， 568（1）： 323.

[16] Pohle-Krauza R J， Carey K H， Pelkman C L. Dietary restraint and menstrual cycle phase modulated L-phenylalanine-induced satiety [J]. Physiol Behav， 2008， 93（4/5）： 851.

[17] 楊琪偉， 楊莉， 熊愛珍， 等. 赤芍和白芍抗炎作用的 UPLC-MS 代謝組學初步研究[J]. 中國中藥雜志， 2011， 36（6）： 694.

[18] 曾平燕， 張宇， 芮雯，等. 2型糖尿病模型大鼠血漿磷脂的UPLC-Q-TOF/MS分析[J]. 藥學學報， 2015， 50（7）： 882.

[19] 朱蔚， 楊世海， 向蘭， 等. 中藥化學成分對花生四烯酸代謝的影響[J]. 中草藥， 1997， 28（3）： 183.

[20] Senda A， Mukai Y， Toda T， et al. Effects of angiotensin Ⅱ receptor blockers on metabolism of arachidonic acid via CYP2C8 [J]. Biol Pharm Bull， 2015， 38（12）： 1975.

[21] Rong Rong， Li Rong-rong， Hou Yan-bao， et al.Mahuang-Xixin-Fuzi decoction reduces the infection of influenza A virus in Kidney-Yang deficiency syndrome mice [J]. J Ethnopharmacol， 2016， 192：217.

[22] Bai Yunnuo， Zhang Haitao， Sun Xiaohan， et al. Biomarker identification and pathway analysis by serum metabolomics of childhood acute lymphoblastic leukemia [J]. Clin Chim Acta， 2014， 436：207.

[23] 華永麗. 當歸揮發油干預大鼠LPS炎癥模型的相關代謝物及代謝通路分析[D]. 蘭州：甘肅農業大學， 2014.

[24] 謝露， 尹曉娟. 新生兒肺表面活性物質研究新進展[J]. 中國兒童保健雜志， 2012， 20（3）： 235.

[25] Lu Chuanjian， Jiang Zhiting， Fan Xuemei， et al. A metabonomic approach to the effect evaluation of treatment in patients infected with influenza A （H1N1） [J]. Talanta， 2012， 100：51.