地龍提取液中蛋白質的穩定性研究

段曉杰，羅世林，汪文琪，王雄飛，湯化琪，孫毅坤

(北京中醫藥大學，北京 100102)

地龍提取液中蛋白質的穩定性研究

段曉杰，羅世林，汪文琪，王雄飛，湯化琪，孫毅坤*

(北京中醫藥大學，北京 100102)

目的:對影響地龍提取液中蛋白質穩定性的因素進行研究。方法:通過考馬斯亮藍法建立了地龍提取液中蛋白質的含量測定方法，并考察了溫度、pH值、無機鹽及有機溶劑等因素對提取液中蛋白質穩定性的影響。結果:在30℃、pH值為7的條件下，提取液中蛋白質的含量最高，而加入無機鹽或有機溶劑后蛋白質含量均有所降低。結論:提取液的最佳保存條件為30℃、pH值7，且提取過程中應盡量減少無機鹽和有機溶劑的使用。

地龍提取液;蛋白質穩定性;考馬斯亮藍法

地龍又名“蚯蚓”，最初記載于《神農本草經》［1］。該藥物性味咸，寒，歸肝、脾、膀胱經，具有清熱止痙、平肝熄風、平喘通絡、利尿的功效［2-6］。課題組前期對斷體地龍提取液進行了創傷愈合的研究，結果表明，地龍提取液具有良好的促進創傷愈合的作用，其主要活性成分為小分子蛋白類成分。作為一種蛋白質染料，考馬斯亮藍G-250可在酸性條件下與蛋白質結合形成考馬斯亮藍G-250-蛋白質復合物，其最大吸收峰為595 nm，且吸光度與蛋白質含量呈線性關系［7］，因此可通過考馬斯亮藍法對地龍提取液中的蛋白質進行含量測定，從而觀察溫度、pH值、無機鹽及有機溶劑等［8］對蛋白質穩定性的影響。

1 儀器與試藥

萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學有限公司);冷凍離心機(TGL20M，湘智離心機廠);PHS-3C型酸度計(上海般特儀器制造有限公司);紫外分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司);勻漿機(IKA T10 basic);牛血清白蛋白(AMERSCO); Tris(C4H11NO3，AMRESCO);氯化鈉(NaCl，分析純，北京化工廠);鹽酸(分析純，北京化工廠);考馬斯亮藍G-250(北京欣經科生物);硫酸銨((NH4)2SO4，北京化工廠);其余試劑均為分析純。

2 地龍提取液的制備

取地龍適量，加入一定量的Tris-HCl緩沖液，冰浴勻漿，離心，取上清液封裝好置于4℃冰箱中儲存備用。

3 蛋白質的穩定性考察

3.1 蛋白質的含量測定

精密稱取牛血清蛋白31 mg，于25 mL容量瓶中定容，搖勻，備用。分別精密吸取牛血清蛋白溶液0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 mL，加Tris-HCl緩沖溶液至0.20 mL后，再加入考馬斯亮藍試劑10 mL，混勻，室溫靜置5 min，于595 nm處測定吸光度。以牛血清蛋白濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，得回歸方程A=34.741C-0.002 6(R2=0.996 5)。結果表明牛血清蛋白在0.002 5～0.025 mg/mL濃度范圍時濃度與吸光度線性關系良好(見圖1)。

圖1 牛血清蛋白濃度與吸光度標準曲線

3.2 溫度、pH值、無機鹽和有機溶劑對蛋白質穩定性的影響

3.2.1 溫度對蛋白質穩定性的影響

取地龍提取液7份，每份2 mL，一份置于冰浴中0℃保持5 min，其余6份分別用水浴鍋加熱至10、20、30、40、50、60℃并保持5 min，測定不同溫度下地龍提取液中蛋白質的含量，結果見圖2。

圖2 溫度與蛋白質含量變化曲線

由圖2可看出，30℃時地龍提取液中蛋白質含量最高，可能是由于溫度過低或過高都會對蛋白的空間結構有一定影響，使之化學性質發生變化、穩定性下降，進而含量降低［9］。其中高溫對地龍勻漿蛋白質穩定性的影響更大，在30℃ ～60℃范圍內，隨溫度的升高，地龍提取液中蛋白質含量顯著下降。

3.2.2 pH值對蛋白質穩定性的影響

取地龍提取液5份，每份2 mL，分別采用鹽酸或1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節提取液的pH值至5，6，7，8，9，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質含量，結果見圖3。

圖3 pH值與蛋白質含量變化曲線

當pH值為7時，蛋白質含量最高，pH值為8時蛋白質含量最低。在不同pH值范圍內，蛋白質的含量變化也不同。可能是由于蛋白質分子是兩性物質，在等電點附近時，水化作用最弱，溶液不穩定［10］造成的。

3.2.3 無機鹽對蛋白質穩定性的影響

取地龍提取液4份，每份2 mL。分別加入氯化鈉29.20，58.40，87.70，116.90 mg，最終得地龍提取液中氯化鈉濃度分別為0.5，1，1.5，2.0 mol/L，振蕩，搖勻，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質含量，結果見圖4。

取地龍提取液4份，每份2 mL。分別加入硫酸銨66.10，132.10，198.20，264.30 mg，最終得地龍提取液中硫酸銨濃度分別為0.5，1，1.5，2.0 mol/L，振蕩，搖勻，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質含量結果見圖5。

圖4 氯化鈉濃度與蛋白質含量變化曲線

圖5 硫酸銨濃度與蛋白質含量變化曲線

由圖4～5可知，無機鹽的濃度與地龍提取液中蛋白質含量呈負相關，即地龍提取液中蛋白質含量隨著氯化鈉和硫酸銨濃度的增加而減少。分析原因可能如下:蛋白質是由親水性和疏水性氨基酸組成，蛋白質疏水基大部分存在于蛋白質分子內部，暴露在外的疏水殘基和親水殘基決定了蛋白質分子的溶解度［10］。當往溶液中加入中性鹽離子時，蛋白質疏水基相互作用減弱，易發生鹽析而使蛋白質溶解度降低。同時離子的作用降低了蛋白質大分子離子的活性又可使其溶解度提高［11］。

3.2.4 有機溶劑對蛋白質穩定性的影響

取地龍提取液6份，每份2 mL。分別加入甲醇0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，最終得地龍提取液中甲醇濃度比(體積比)分別為0%，10%，20%，30%，40%，50%，振蕩，搖勻，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質含量，結果見6。

取地龍提取液6份，每份2 mL。分別加入乙腈0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，最終得地龍提取液中乙腈濃度比(體積比)分別為0%，10%，20%，30%，40%，50%，振蕩，搖勻，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質含量，結果見7。

圖6 甲醇濃度與蛋白質含量變化曲線

圖7 乙腈濃度與蛋白質含量變化曲線

由圖6～7可以看出，地龍提取液中蛋白質含量與有機溶劑體積分數也呈負相關。地龍提取液中蛋白質含量隨甲醇和乙腈體積分數的增大而降低。可能是由于有機溶劑能降低溶液的電解常數，增加蛋白質分子不同電荷間的引力，使之聚集析出;且有機溶劑可與水作用，破壞蛋白質分子表面水化層，使蛋白質分子脫水聚集析出，從而使蛋白質含量降低。

4 討論與總結

本實驗通過測定不同溫度、不同pH值、不同濃度無機鹽以及不同濃度有機溶劑下蛋白質的含量來考察蛋白質的穩定性。結果發現，當地龍提取液在30℃左右保存時，測得蛋白質的含量最高;當溶液pH值為7時，活性較好，測得蛋白質的含量也最高。而無機鹽和有機溶劑則會不同程度的降低地龍提取液中蛋白質的穩定性。因此實驗中將地龍提取液保存在30℃下、提取液pH值控制在7左右為宜，且應盡量避免或減少對無機鹽及有機溶劑的使用。

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［7］邱葵，司天潤.用考馬斯亮藍測定動物藥材中可溶性蛋白質含量方法初探［J］.中國中醫藥信息雜志，2007，14(4):49-50.

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［9］樊文玲，詹秀琴，劉小靜，等.溫度和pH值對地龍提取液物化性質的影響規律的研究［J］.中成藥，2008，30(6):852-854.

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Stability of Protein in Earthworm Extract

DUAN Xiao-jie，LUO Shi-lin，WANG Wen-qi，WANG Xiong-fei，TANG Hua-qi，SUN Yi-kun*
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

Objective:Factors influencing the stability of the protein in earthworm extract were researched in this article.Methods:Braford was adopted for determination of protein to observe the influences which temperature，pH，inorganic salt and organic solvents had on the stability of protein.Results:It showed that the protein was the stablest under 30℃ and pH=7 and became weaker when inorganic salt and organic solvents were added.Conclusion:The optimal preservation condition for earthworm extract is 30℃ and pH=7，and inorganic salt and organic solvents should be limited in the extraction process.

Earthworm extract;Stability of protein;Braford

R28

A

1002-2406(2017)02-0031-03

國家自然科學基金面上項目(No.81373942)

段曉杰(1991-)，女，北京中醫藥大學2015級中藥分析專業碩士研究生。

孫毅坤*(1965-)，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向:藥品質量控制。

2016-08-16

修回日期:2016-09-10