“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血大鼠腦組織中PERK蛋白表達影響的實驗研究

鄒偉，牛明明，于學(xué)平，孫曉偉，滕偉，戴曉紅，袁夢飛，陳秋欣，劉鵬，姚冬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血大鼠腦組織中PERK蛋白表達影響的實驗研究

鄒偉1，牛明明2，于學(xué)平1，孫曉偉1，滕偉1，戴曉紅1，袁夢飛2，陳秋欣1，劉鵬2，姚冬2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:探討“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血大鼠腦組織細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路關(guān)鍵蛋白PERK表達的影響。方法:將Wistar雄性大鼠隨機分為SHAM組、模型組、針刺組、3-MA組、3-MA+針刺組，再將各組隨機分為4個時間亞組，每亞組6只。采用自體血注射的方法建立腦出血大鼠模型，3-MA組于造模前15 min注射3-MA自噬抑制劑，針刺組和3-MA+針刺組于造模成功后以“百會”透“曲鬢”針刺法進行干預(yù)，于相應(yīng)時間節(jié)點取材。根據(jù)改良版神經(jīng)缺損評分系統(tǒng)(mNSS)對大鼠神經(jīng)功能進行評價，并用Western Blot法分析PERK蛋白相對表達量的變化。結(jié)果:神經(jīng)功能評價方面，造模前大鼠無神經(jīng)功能缺損體征。造模后SHAM組大鼠各時間點評分無顯著差異，其余各組神經(jīng)功能缺損體征于72 h時各項缺損體征達到最高峰，后有所緩解，7 d時針刺組神經(jīng)功能缺損體征明顯改善(P＜0.05)，3-MA組于各時間點神經(jīng)功能缺損最重，3-MA+針刺組神經(jīng)缺損情況較3-MA組輕。Western Blot法檢測結(jié)果顯示，除SHAM組外，其余各組PERK蛋白相對表達量均有隨時間變化的趨勢，分別于6h最低，后逐漸升高，至7 d最高;相同時間點，針刺組相對表達量最高(P＜0.01)，3-MA組蛋白相對表達量明顯低于其他各組(P＜0.05)，3-MA+針刺組表達量略高于3-MA組。結(jié)論:“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)具有促進作用，可能促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路的激活。

自噬;針刺;腦出血;PERK通路

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性腦實質(zhì)出血，出血后的神經(jīng)細胞死亡的過程是影響患者預(yù)后和神經(jīng)功能缺失情況的關(guān)鍵步驟。細胞損傷及營養(yǎng)匱乏將導(dǎo)致細胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ER stress)的發(fā)生，并使細胞自發(fā)性啟動一系列應(yīng)激反應(yīng)來緩解損傷，以保持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細胞正常生理功能的發(fā)揮，PERK通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response，UPR)的主要通路之一，該通路的激活與自噬體的形成有著密切的聯(lián)系［1］，是研究自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制的重要切入點。頭針針刺對急性腦出血后腦損傷和腦水腫具有拮抗作用［2］，還可以抑制TNF-α介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)［3］，并促進神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)表達［4］，從而發(fā)揮其腦出血后的腦保護和治療作用。本研究以腦出血大鼠為模型，研究“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血后大鼠神經(jīng)功能及PERK通路相關(guān)蛋白PERK表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

臺式牙鉆機(中國上海齒科醫(yī)械廠，307-6型);立體定位儀(中國成都儀器廠，STW-1型);組織勻漿器(瑞士Fluka公司);低溫冷凍離心機(德國Thermo公司，002421);電泳儀(美國 BIO-RAD公司，1645070);Mini P-4電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司，MP-3030);濕轉(zhuǎn)電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司，MP-3035);MultiSkan3酶標(biāo)儀(德國Thermo公司，51119000);3-Methyladenine(3-甲基腺嘌呤，3-MA，美國CALBIOCHEM公司，189490);蛋白抽提試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0033);BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0010);BSA(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0007);蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0015);電泳緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0014A);TBST(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0023C3);中分子量蛋白Marker(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0061);濕轉(zhuǎn)緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0021A);NC膜(0.45um，美國Millipore公司，HATF00010);PERK(C33E10，Cell Signaling Techology，3192);#-actin(天德悅(北京)生物科技公司，TDY041);山羊抗兔IgG HRP(天德悅生物科技公司，S004)。

1.2 實驗動物

符合國家二級動物標(biāo)準(zhǔn)的健康Wistar雄性大鼠120只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。動物飼養(yǎng)于清潔級動物室，室溫控制在18℃ ～22℃，濕度45% ～55%，日光周期 12 h(08:00 am～08:00 pm)，自由覓食飲水。實驗前飼養(yǎng)(8±2)d，體質(zhì)量符合(330±30)g的標(biāo)準(zhǔn)后入組，造模前12 h開始禁食，6 h前開始禁水。

1.3 實驗分組

將符合實驗標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機分為5組，即空白對照組(SHAM組)、模型對照組(模型組)、3-MA抑制劑組(3-MA組)、針刺組、3-MA抑制劑+針刺組(3-MA+針刺組)，每組24只，再將各組隨機分為4個時間亞組(造模后12 h、24 h、72 h、7 d)，每亞組6只。SHAM組按正常造模操作，但不注血，分別于對應(yīng)時間點取材;模型組造模后于對應(yīng)時間點取材;針刺組于造模后6 h開始以28號1寸毫針由患側(cè)百會穴透刺曲鬢穴，每24 h針刺1次(參照《實驗動物穴位圖譜》取穴，進針0.8寸，留針30 min，每5 min捻轉(zhuǎn)1次，每次5 min，針刺過程中共捻針3次);3-MA組在造模前15 min于前囟點右1.5 mm，后0.8 mm定位鉆孔注射3-MA抑制劑(400 nM);3-MA+針刺組于注射抑制劑和自體血后，給予與針刺組相同的針刺方法進行干預(yù)。

1.4 動物模型制備

依據(jù)大鼠立體定位圖譜［5］和自體血注射的方法［6］制備腦出血大鼠模型。大鼠以腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)的方法進行麻醉，并以俯臥位固定于立體定位上，取兩耳尖連線中點備皮、切口，充分暴露前囟點及冠狀縫，以立體定位儀定位注血點(前囟點為中心，右側(cè)3.5 mm，后側(cè)0.2 mm)，用1.0 mm直徑牙鉆頭鉆孔至硬腦膜表面。鼠尾消毒后于尾端3 cm處剪斷，以微量注射器取血50 μl，并沿鉆孔垂直進針6 mm，以25 μl/min的注血速度，將自體血注入尾狀核，留針5 min后緩慢出針。術(shù)后局部噴灑慶大霉素并用牙科水泥密封顱骨鉆孔，縫合頭皮并消毒創(chuàng)口皮膚，斷尾處消毒包扎，以防感染。

1.5 動物模型成功標(biāo)準(zhǔn)

參考Bederson神經(jīng)功能缺損體征評分法(Postural Reflex Test)［7］，對造模前后大鼠的神經(jīng)功能進行評分，評分＞1者判定為出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征，且處死后取腦證實顱內(nèi)血腫者視為造模成功，否則棄之不用，在同批大鼠中隨機抽樣重新入組。

1.6 實驗動物干預(yù)方法

SHAM組以造模方法操作，但不注血、不做干預(yù)，分別于對應(yīng)時間點取材;模型對照組造模后于對應(yīng)時間點取材;抑制劑組在造模前15 min于前囟點右1.5 mm，后 0.8 mm定位鉆孔注射 3-MA抑制劑(0.2 mg/kg);針刺組于造模后6 h開始以28號1寸毫針由患側(cè)百會穴透刺曲鬢穴，每24 h針刺1次(參照《實驗動物穴位圖譜》取穴，進針0.8寸，留針30 min，每5 min捻轉(zhuǎn)1次，每次5 min，共計3次)，3-MA+針刺組于注射抑制劑和自體血后，以于針刺同樣的針刺方法進行干預(yù)。

1.7 神經(jīng)功能缺損評價

參考大鼠神經(jīng)功能缺損評價系統(tǒng)(Neurological Severity Score，NSS)［8］、Bederson神經(jīng)功能缺損體征評分法(Postural Reflex Test)［7］、網(wǎng)屏測驗(Screen Test)［9-10］和平衡木測驗評分法 (Balance Beam Test)［11］，建立改良版大鼠神經(jīng)功能缺損評價系統(tǒng)(modified Neurological Severity Score，mNSS)，分別于造模前和造模后6 h處及死前對大鼠神經(jīng)功能進行評分(評分精確至0.1)，最后計算總分，最高分為11分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)如前所述［12］。

1.8 Western Blot法分析蛋白相對表達量

大鼠于相應(yīng)時間點過量麻醉后，直接斷頭取腦，將腦組織樣本迅速放入液氮中速凍，通過RIPA蛋白抽提試劑盒提取腦組織蛋白，以BCA蛋白濃度測定法對腦組織蛋白進行定量，上樣后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，以一抗PERK(1∶1 000)4℃孵育過夜，二抗(1∶10 000)孵育1 h，以ECL試劑進行顯影成像，光片于凝膠成像系統(tǒng)下白光掃描，進行吸光度分析，用同一標(biāo)本內(nèi)參β-actin(1∶10 000)進行校正，以蛋白相對表達量=目的條帶表達強度/β-actin表達強度為公式計算出蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較用ANOVA方差分析，兩兩比較采用 SNK-q檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)為0.05，即P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組大鼠神經(jīng)功能評價結(jié)果

模前大鼠mNSS評分為0分，即無神經(jīng)功能缺損體征。造模后SHAM組大鼠各時間點評分無顯著差異，仍為0分，其余各組出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征，于72 h時各項體征達到最高峰，而后有所緩解，至7 d時，針刺組神經(jīng)功能缺損體征明顯改善，與其他各實驗組兩兩比較，差異顯著(P＜0.05)，模型組7 d時神經(jīng)功能恢復(fù)情況略好于3-MA組和3-MA+針刺組; 3-MA組于各時間點神經(jīng)功能缺損最為嚴重(P＜0.05)，3-MA+針刺組神經(jīng)缺損情況較3-MA組輕。結(jié)果比較和分析如表1、圖1所示。

表1 各組造模后神經(jīng)功能缺損綜合評分mNSS比較(±s，n=6)

表1 各組造模后神經(jīng)功能缺損綜合評分mNSS比較(±s，n=6)

注:針刺組與其他各組兩兩比較，★P＜0.05;3-MA組與其他各組兩兩比較，▲P＜0.05。

組別n 6 h 24 h 72 h 7 d SHAM組6 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 6 6.97±3.31 8.20±0.26 10.56±0.15 4.85±0.14針刺組 6 6.30±0.24 7.45±0.18 7.83±0.22▲2.14±0.17▲3-MA組 6 7.63±0.29★9.16±0.20★10.85±0.17★6.41±0.21★3-MA+針刺組6 7.21±0.25 8.68±0.23 9.95±0.29 5.60±0.19

圖1 各組神經(jīng)功能缺損綜合評分(mNSS)比較

2.2 各實驗組大鼠腦組織中PERK的Western Blot法檢測結(jié)果

如表2、圖2所示，各實驗組組PERK蛋白相對表達量呈時間相關(guān)性，6 h時最低，7 d時表達量最高，SHAM組PERK蛋白相對表達量于個時間點未見明顯差異(P＞0.05);相同時間點的組間比較，針刺組相對表達量均高于其他各組(P＜0.05);3-MA組PERK蛋白相對表達量最低(P＜0.05)，3-MA+針刺組相對表達量略高于3-MA組但低于模型組。

表2 各組造模后PERK蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較(±s，n=6)

表2 各組造模后PERK蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較(±s，n=6)

注:針刺組與其他各組兩兩比較，★P＜0.05;3-MA組與其他各組兩兩比較，▲P＜0.05。

組別n 6 h 24 h 72 h 7 d SHAM組6 0.30±0.03 0.31±0.04 0.31±0.03 0.32±0.04模型組 6 0.43±0.05 0.65±0.08 1.17±0.12 2.36±0.15針刺組 6 0.78±0.12 0.93±0.14 1.92±0.16 3.13±0.08 3-MA組 6 0.26±0.09 0.29±0.03 0.53±0.03 2.05±0.10 3-MA+針刺組6 0.36±0.04 0.46±0.07 0.68±0.05 2.21±0.07

圖2 各實驗組PERK蛋白免疫印跡分析結(jié)果比較

3 討論

3.1 PERK通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬中的作用

細胞穩(wěn)態(tài)的重構(gòu)對疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER Stress，ERS)和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)對細胞在應(yīng)激條件下的存活密切相關(guān)［13-15］，ERS和UPR對疾病的影響也被越來越多實驗研究所證實［16-19］。當(dāng)細胞各項生理機能處于正常水平時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運也呈動態(tài)平衡狀態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的常駐分子伴侶GRP78與UPR三個效應(yīng)元件即PERK、IRE1和ATF6穩(wěn)定結(jié)合，使三者處于失活狀態(tài)。一旦細胞遭受損傷，內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞，蛋白質(zhì)合成的合成受到干擾，致使大量錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白的堆積，GRP78就會與三者解離，轉(zhuǎn)而結(jié)合錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白，隨著GRP78的解離，PERK、IRE1和ATF6也隨之被激活，通過調(diào)控其下游基因的表達來降低蛋白質(zhì)的合成或促進蛋白和細胞碎片的降解，使細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)得以恢復(fù)、使細胞的正常生理功能得以保護。

PERK(protein kinase R -like endoplasmic reticulum kinase)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常駐跨膜酶蛋白，在人體內(nèi)由EIF2AK3(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3)基因編碼，GPR78的解離導(dǎo)致PERK的自磷酸化形成二聚體，并磷酸化真核翻譯起始因子EIF2α，從而降低了細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的翻譯效率，致使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的減少，緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)因蛋白質(zhì)過載引發(fā)的應(yīng)激狀態(tài)，對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重構(gòu)具有促進作用。盡管未折疊蛋白反應(yīng)的三條通路均參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞自噬或凋亡的細胞穩(wěn)態(tài)重構(gòu)過程，越來越的研究表明PERK及其通路的特定下游因子在細胞存活或死亡的發(fā)展趨勢上發(fā)揮著不可替代的作用。有研究［20］發(fā)現(xiàn)，維系細胞穩(wěn)態(tài)的自噬流的形成需要PERK通路的參與，而EIF2α的磷酸化也是自噬誘導(dǎo)的必要條件，在自噬的初始誘導(dǎo)階段，一系列EIF2α磷酸化依賴型選擇性翻譯介導(dǎo)了ATG12的表達，從而促進了ATG5-ATG12-ATG15泛素連接系統(tǒng)的形成，推進自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的延展和成熟。由此可見，PERK通路對細胞自噬及細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持和恢復(fù)具有重要意義。

3.2“百會”透“曲鬢”針刺法對PERK通路的影響

本實驗研究分別對各組大鼠腦組織中PERK通路關(guān)鍵蛋白PERK進行Western Blot法檢測，結(jié)果顯示，SHAM組于各時間點PERK通路相關(guān)蛋白的相對表達量較低，且并無顯著變化;而其余各組的蛋白表達量呈時間相關(guān)性，6 h時最低，至7 d時最高，而相同時間點內(nèi)組間比較，針刺組的表達量明顯高于其他各組(P＜0.05)，模型組次之，3-MA組的相對表達量為最低，3-MA+針刺組的表達量略高于3-MA組但低于模型組。實驗結(jié)果表明，大鼠腦出血模型建立后，隨著大鼠腦組織損傷的加重，PERK通路被激活，導(dǎo)致PERK蛋白表達水平升高，而“百會”透“曲鬢”針刺法的干預(yù)則使PERK通路的活躍程度明顯提高，且此影響有隨腦出血時間的進展和針刺干預(yù)次數(shù)的累加而愈加明顯的趨勢，同時，3-MA抑制劑對自噬的抑制作用同時也抑制了PERK通路的活躍程度，而針刺刺激的干預(yù)(3-MA+針刺組)，則在一定程度上緩解了這種抑制作用，使PERK通路仍可持續(xù)激活，由此可見，“百會”透“曲鬢”針刺法可以促進PERK通路的激活，且可緩解由3-MA抑制劑對自噬的抑制作用和PERK通路活躍度減低情況。

頭針針刺對腦出血治療作用已經(jīng)被大量的臨床實驗所證實，而隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對針灸治療疾病的機理研究也愈加深入。有研究證實，針刺百會穴在改善大鼠腦出血后的局部腦血流量的同時，對神經(jīng)功能癥狀的恢復(fù)也發(fā)揮著積極作用［21-22］。劉氏［23］研究證明，針刺能提高急性腦出血家兔腦組織SOD活性，具有抗脂質(zhì)過氧化的作用。同時，針刺還可能通過改變血清中抑制因子的表達來促進神經(jīng)干細胞分化，從而促進腦出血后腦損傷的修復(fù)［24］。鄒偉教授科研團隊的前期實驗研究從組織形態(tài)學(xué)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎性反應(yīng)研究、神經(jīng)重塑和細胞凋亡機制等［25-27］角度驗證了“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血大鼠腦組織神經(jīng)細胞的保護作用及對神經(jīng)功能恢復(fù)的積極意義，本研究在此基礎(chǔ)之上，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路為切入點，進一步探討了“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血大鼠腦組織PERK通路的的激活作用，證實了“百會”透“曲鬢”針刺法可以改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損狀況，揭示了“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血大鼠神經(jīng)細胞保護的潛在機制，為針刺機理研究和腦出血治療方案的探索提供了新的思路。

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Effect of Baihui-Qubin Acupuncture Therapy on PERK Protein Expression in Intracerebral Hemorrhage Rat Models

ZOU Wei1，NIU Ming-ming2，YU Xue-ping1，SUN Xiao-wei1，TENG Wei1，DAI Xiao-hong1，YUAN Meng-Fei2，CHEN Qiu-xin1，LIU Peng2，YAO Dong2
(1.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the effect of Baihui-Qubin acupuncture on PERK expression of PERK pathway key proteins in intracerebral hemorrhage(ICH)rat models.Methods:Wistar rats were randomly divided into five groups:sham group，ICH model group，inhibitor group，acupuncture group and inhibitor+acupuncture group(24 rats in each group);4 sub-groups were divided based on different time points(12hrs，24hrs，72hrs，7days)，with 6 rats in each subgroup.Establish intracerebral hemorrhage rat models by autologous blood injection.Brain tissues were harvested at altered time points in sham group and ICH model group.3-MA inhibitor was injected before 15 minutes of autologous blood injection.Baihui-Qubin acupuncture was implemented in acupuncture group and inhibitor+acupuncture group from 6hrs after ICH(once per 24hrs).Brain tissues were also harvested at altered time points.Evaluate the neurological deficit at 6hrs after ICH and before tissues being harvested.Western Blot studies were performed to analyze the expression of PERK in brain tissues.Results:Neurological deficit evaluation:the neurological behave in acupuncture group was improved，which was associated with the acupuncture involvement.Western Blot results showed that the expression of PERK was increased in acupuncture group and reduced in inhibitor group as well as the inhibitor+acupuncture group which was slightly higher than that in the inhibitor group.Conclusion:Baihui-Qubin acupuncture therapy can alleviate the neurological deficits and also has an effect on PERK pathway activation.

Autophagy;Acupuncture;ICH;PERK pathway

R246

A

1002-2406(2017)02-0075-05

國家自然科學(xué)基金項目(No.81473764);國家留學(xué)基金項目(No.201408230060)

鄒偉(1965-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病的研究工作。

2016-05-12

修回日期:2016-06-07