孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對下丘腦
--垂體--腎上腺軸敏感性的影響及發生機制

何 廈，徐 丹，2，盧 娟，董婉婷，胡澤文，汪 暉，2

（1.武漢大學基礎醫學院藥理學系，湖北武漢 430071；2.發育源性疾病湖北省重點實驗室，湖北武漢 430071）

孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對下丘腦
--垂體--腎上腺軸敏感性的影響及發生機制

何 廈1，徐 丹1，2，盧 娟1，董婉婷1，胡澤文1，汪 暉1，2

（1.武漢大學基礎醫學院藥理學系，湖北武漢 430071；2.發育源性疾病湖北省重點實驗室，湖北武漢 430071）

目的觀察孕期尼古丁暴露（PNE）所致子代大鼠高脂飲食下下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸應激高敏感性改變，并探討其發生機制。方法受孕Wistar大鼠從孕9～20 d sc給予尼古丁2 mg·kg-1。自然出生仔鼠斷奶后給予高脂飲食喂養至20周（PW20），其中一半仔鼠從PW17至PW20給予3周不可預計性慢性刺激（UCS）。HE染色觀察組織形態學改變，放免試劑盒和ELISA分別檢測大鼠血清促腎上腺皮質激素（ACTH）及皮質酮（CORT）水平，PCR檢測ACTH釋放激素（CRH）、精氨酸加壓素（AVP）、囊泡谷氨酸轉運蛋白2（VGluT2）、谷氨酸脫羧酶65（GAD65）、鹽皮質激素受體（MR）、糖皮質激素受體（GR）和谷氨酸脫羧酶67（GAD67）等相關基因的mRNA表達。結果正常對照組雌、雄仔大鼠經UCS刺激后，血清ACTH和CORT分別升高了1.96倍（P＜0.01），1.63倍（P＜0.01）和3.24倍（P＜0.01），3.54倍（P＜0.01），PNE組雌、雄仔大鼠經UCS刺激后，血清ACTH和CORT分別升高了3.96倍（P＜0.01），3.04倍（P＜0.01）和5.98倍（P＜0.01），5.22倍（P＜0.01）。與UCS處理的正常對照組仔大鼠相比，UCS處理的PNE組雌、雄仔大鼠下丘腦AVP mRNA表達分別升高了2.04倍（P＜0.01）和1.13倍（P＜0.05），雌性下丘腦CRH mRNA表達和VGluT2/GAD65 mRNA比值分別升高了2.49倍（P＜0.01）和1.14倍（P＜0.01）。全部PNE組雌、雄仔大鼠海馬各區均出現不同程度的病理損傷，表現為神經元數量減少、排列稀疏和細胞間隙增大。與無UCS處理的正常對照組相比，無UCS處理的PNE雌、雄仔大鼠海馬MR/GR mRNA比值分別降低了88.0%和86.0%（P＜0.01），GAD67 mRNA表達分別升高了1.38倍和1.97倍（P＜0.05）；與UCS處理的正常對照組相比，UCS處理的PNE組雌性仔大鼠海馬GAD67 mRNA表達升高了2.17倍（P＜0.05）。結論PNE可致高脂飲食成年子代大鼠HPA軸應激高敏感性發生，其機制可能與海馬MR/GR比值失衡、GAD67表達上調，進而介導下丘腦局部潛在興奮性增加有關。

尼古丁；海馬；下丘腦-垂體-腎上腺軸；高敏感性

有關孕期尼古丁暴露（prenatal nicotine expo?sure，PNE）的危害已有許多相關研究，如宮外孕［1］、早產和宮內發育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）［2-3］，后期還可能導致出生后子代生長發育不良［4］、學習記憶損傷［5］；動物實驗也發現PNE子代大鼠患糖尿病和肥胖病的概率增加［6-7］。下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pitu?itary-adrenal axis，HPA）是機體重要的神經內分泌軸。胚胎早期的不良宮內環境會導致胎兒HPA軸發育異常，成年后表現為諸多神經內分泌相關胎源性疾病易感［8］。我們的前期研究表明，PNE可導致IUGR子代HPA軸相關神經內分泌代謝改變，成年后HPA軸出現高應激敏感性現象［9］。然而PNE介導HPA軸高應激敏感性的發生機制尚不清楚。本研究采用PNE子代大鼠IUGR模型，出生后給予高脂飲食喂養并給予不可預計性慢性應激（unpredict?able chronic stress，UCS），觀察子代大鼠HPA軸敏感性改變的現象，進一步從海馬高位調節中樞調控失衡層面，探討HPA軸高敏感性的發生機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

尼古丁（美國Sigma公司）；大鼠促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）放射免疫試劑〔北京生命科學技術研究所（中國北京）〕；大鼠皮質酮（corticosterone，CORT）ELISA檢測試劑盒（美國R&D生物科技有限公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；PrimeScript RT-PCR Kit（大連寶生物工程有限公司）；SYBR Select Master Mix（美國Applied Biosystems公司）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 動物分組及樣本處理

未交配SPF級別健康Wistar大鼠（體質量：雄性260～300 g，雌性180～220 g，（湖北省預防醫學科學院實驗動物中心）提供，合格證號：2008-0005。大鼠適應性喂養1周后，每晚18∶00以雌雄2∶1合籠，次晨觀察雌鼠陰栓或陰道涂片，以查到陰栓或精子時間作為受孕0 d（gestational day 0，GD0）。受孕大鼠隨機分為尼古丁組和正常對照組，每組9只。于GD9 sc給予尼古丁2 mg·kg-1至GD20，正常對照組給予等體積生理鹽水。孕鼠自然分娩后，選取仔鼠數量在8～14只的母鼠，取每只母鼠哺乳的雄、雌性仔鼠各2只，1/2仔鼠高脂飲食喂養至出生后20周（PW20）處死，另1/2仔鼠高脂飲食喂養至PW17尾部取血200 μL而后給予3周UCS（每天8∶00隨機給予一種刺激，包括禁食、禁水24 h、4℃冰水游泳、夾尾1 min、晝夜顛倒、50℃熱應激5 min）。仔鼠于8∶00 am-10∶00 am斷頭取血并分離血清，迅速分離海馬、下丘腦等組織置于-80℃的冰箱內保存備用，同時每組留取1～2個全腦組織用4%多聚甲醛溶液固定。

1.3 HE染色觀察海馬組織形態

成年仔鼠的固定腦組織經石蠟包埋切片后進行HE染色，光鏡下觀察海馬形態改變。

1.4 血清ACTH及CORT濃度檢測

采用ACTH放免試劑盒和CORT ELISA試劑盒分別檢測大鼠血清中的ACTH和CORT含量。具體操作步驟見相應說明書。

1.5 RNA提取及實時熒光定量PCR檢測

用Trizol法提取大鼠海馬及下丘腦組織總RNA，并參照Prime Script RT-PCR試劑盒步驟合成cDNA，參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進行實時定量PCR檢測。檢測基因包括：磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy?drogenase，GAPDH）、促腎上腺皮質激素釋放激素（ACTH releasing hormone，CRH）、精氨酸加壓素（arginine vasopressin，AVP）、囊泡谷氨酸轉運蛋 白 2（vesicularglutamate transporter2，VGluT2）、谷氨酸脫羧酶65（glutamic acid decar?boxylase 65，GAD65）、GAD67、鹽皮質激素受體（mineralocorticoid receptor，MR）和糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）。相關引物應用軟件Primer Premier 5.0進行引物設計，得到的特異性序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，經PAGE純化。引物序列及PCR反應條件見表1。采用雙標準曲線法來獲得目的基因的相對定量結果。

1.6 統計學分析

應用SPSS19和Prism 5.0進行數據分析。所有的數據均以表示。兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗；同一組慢性刺激前、后的比較采用配對樣本t檢驗。以P＜0.05為有統計學意義。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

2 結果

2.1 孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對血清ACTH和CORT水平的影響

結果顯示，UCS處理前，PNE組雌、雄性仔大鼠血清ACTH和CORT水平均顯著低于正常對照組（P＜0.01）；UCS刺激后，PNE組雌、雄仔大鼠血清ACTH水平顯著高于相應的正常對照組（P＜0.01，P＜0.05），雌性仔大鼠血清CORT水平顯著高于相應的正常對照組（P＜0.05）(表2)。UCS處理后，正常對照和PNE組雌、雄仔大鼠血清ACTH和CORT濃度均顯著升高（P＜0.01）。

2.2 孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對下丘腦應激活性及興奮/抑制性神經元標志基因表達的影響

表3結果顯示，給予UCS處理的PNE組雌性仔鼠下丘腦CRH mRNA表達及雌、雄性仔大鼠下丘腦AVP mRNA表達顯著高于給予UCS處理的正常對照組（P＜0.01）。無UCS處理情況下，與正常對照組比，PNE組雌性仔大鼠丘腦VGluT2 mRNA和GAD65 mRNA表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），雄性仔大鼠下丘腦VGluT2 mRNA顯著降低（P＜0.01），GAD65無明顯改變。給予UCS處理情況下，與正常對照組相比，PNE組雌、雄性仔大鼠下丘腦GAD65 mRNA表達均顯著高（P＜0.01，P＜0.05），VGluT2無明顯改變，雌性仔大鼠下丘腦VGLUT2/GAD65比值顯著升高（P＜0.01）。

2.3 孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對海馬形態的影響

UCS處理和未處理的正常對照組仔大鼠海馬神經元均排列緊密、細胞核染色均一；無UCS處理的PNE組雌性仔大鼠海馬錐體細胞層CA1、CA2、CA3區和UCS處理的PNE組海馬CA1區細胞排列疏松，細胞核染色較淺；無UCS處理UCS的PNE組雄性仔大鼠海馬錐體細胞層CA3區和UCS處理的PNE組雄性仔大鼠海馬DG、CA1及CA3區細胞間隙增大，排列疏松（圖1）。

Tab.2 Effect of prenatal nicotine exposure（PNE）on serum ACTH and CORT level in female and male offspring rats under high fat diet

Tab.3 Effect of PNE on mRNA expression of CRH，AVP，VGluT2 and GAD65 in hypothalamus of female and male offspring rats under high fat diet

Fig.1 Effect of PNE on morphology of hippocampus in female（A）and male(B)offspring rats under high fat diet. See Tab.3 for rat treatment.DG：dentate gyrus.Arrows show the intercellular spaces dilation and nuclear staining lightness of hippocampal CAs and DG area.

2.4 孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對海馬MR和GR mRNA表達的影響

表4結果顯示，無UCS處理的PNE組雌、雄性仔大鼠海馬基因MR mRNA表達較無UCS處理的正常對照組顯著降低（P＜0.01），GR和GAD67 mRNA表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。UCS處理的PNE組雌性仔大鼠海馬MR、GR及GAD67 mRNA表達較UCS處理的正常對照組均顯著升高（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）；雄性仔大鼠MR和GR mRNA也顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），GAD67無明顯改變。無UCS處理的PNE組雌、雄性仔大鼠海馬MR/GR表達比值顯著低于無UCS處理的正常對照組（P＜0.01）。

Tab.4 Effect of PNE on mRNA expression of MR，GR and GAD67 in hippocampus of female and male offspring rats under high fat diet

3 討論

我們的前期研究已證實，PNE出生后正常飲食的成年子代IUGR發生率增加，大鼠血清ACTH和CORT水平降低，HPA軸表現為低基礎活性［10］。許多研究指出，高脂飲食可促進下丘腦室旁核CRH的合成和分泌，并增加慢性應激后腎上腺CORT的釋放［11-12］。既往研究表明，PNE可能導致HPA軸功能異常，出生后高脂飲食會加重大腦損傷［13］，在受到慢性應激后HPA軸功能異常更加明顯［14］。本研究結果顯示，UCS后，血清ACTH和CORT水平及各自增長率均明顯升高，同時下丘腦CRH和AVP的表達也顯著升高，這進一步證實PNE可引起正常和高脂飲食下成年子代HPA軸高應激敏感性改變。

下丘腦PVN區域的下丘腦PVN區神經內分泌小細胞（parvocellular neuroendocrine cells，PNC）通過接受來自中樞的興奮/抑制信號，以此增加/降低CRH和AVP的合成和分泌［15］。谷氨酸（glutamic acid，Glu）能和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能傳入信號的重塑是下丘腦PVN區興奮/抑制失衡的潛在機制。已知Glu和GABA是腦內的兩個重要的神經遞質，前者通過檸檬酸循環合成，由VGluT運輸至突觸囊泡釋放后，與突觸后膜谷氨酸受體結合而發揮作用。GABA的合成關鍵酶為GAD其在腦內有兩種同工酶GAD67和GAD65。GAD67以高飽和的全酶形式存在，與Glu有高的親和力，參與病理條件下GABA的合成和傳遞，而GAD65常以無活性的輔酶形式存在于神經末梢的突觸囊泡膜上，參與生理條件下GABA的突觸傳遞［16］。VGluT2和GAD65在下丘腦組織中的分布分別與Glu能和GABA能神經末梢高度一致，并分別參與了Glu的突觸傳遞和GABA的合成，被認為是Glu能和GABA能神經元的特異性標志物。在本研究中，UCS處理和未處理對PNE組仔大鼠下丘腦中VGLuT2基因的低表達無影響，但因給予UCS處理導致PNE組仔大鼠下丘腦中GAD65基因顯著升高，使得VGLuT2/GAD65比值顯著增高。由此PNE子代下丘腦存在局部的興奮性改變，這種改變可能是介導子代成年后HPA軸高應激敏感性的主要原因。

海馬是HPA軸應激反應的高位調節中樞，MR和GR分別參與基礎及應激狀態下HPA軸的負反饋調節［17］。MR和GR的活化可進一步激活海馬相應區域的GABA能神經元，最終表現為對HPA軸的負反饋抑制信號。已有研究證實，海馬區MR/GR比值降低可使海馬在應激狀態下對HPA軸的調節能力減弱，導致HPA軸高敏感性的發生［18］。本研究中，無UCS處理的PNE組雌、雄仔大鼠MR基因表達顯著降低，GAD67表達顯著升高，MR/GR比值顯著降低；有UCS處理的PNE組雌、雄仔大鼠MR基因表達顯著升高，雌性仔大鼠GAD67基因表達顯著升高，雄性無顯著差異。綜合形態學上的改變，我們推測在發育過程中由于PNE暴露損傷海馬發育，造成MR/GR比值失衡和海馬結構、功能永久性病理改變，在此基礎上機體表現出GAD67表達上調的代償性改變，上調的GAD67表達可將海馬局部的興奮性遞質Glu向抑制性遞質GABA轉化，在UCS后表現為海馬對HPA軸負反饋減弱，進一步導致HPA軸高應激敏感性發生。

綜上所述，PNE子代大鼠出生后高脂飲食可致HPA軸應激敏感性增加，其機制可能與海馬MR/ GR比值失衡、GAD67基因表達代償性上調，進而導致下丘腦局部潛在興奮性增強，最終表現為HPA軸的高應激敏感性改變。

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Prenatal nicotine exposure induced high sensitivity of hypothalamic-pituitary-adrenal axis in offspring rats under high fat diet

HE Xia1,XU Dan1,2,LU Juan1,DONG Wan-ting1,HU Ze-wen1,WANG Hui1,2

(1.Department of Pharmacology,School of Basic Medical Sciences,Wuhan University, Wuhan 430071,China;2.Hubei Provincial Key Laboratory of Developmentally Originated Disease,Wuhan 430071,China)

OBJECTIVETo observe prenatal nicotine exposure(PNE)induced high sensitivity of hypo?thalamic-pituitary-adrenal(HPA)axis in offspring rats which were fed with a high-fat diet,and to explore the mechanism.METHODSNicotine(2 mg·kg-1per day)was injected subcutaneously to preg?nant Wistar rats from gestational day(GD)9 to GD20,and then the young rats were naturally delivered. After weaning,half of the offspring was fed with a high-fat diet until postnatal weeks(PW)20.The others were exposed to unpredictable chronic stress(UCS)from PW17 to PW20.The pathological changes in the hippocampus were analyzed by HE staining.The blood concentration of adrenocorticotropic hormone (ACTH)and corticosterone(CORT)was detected by RIA kits and ELISA kits,respectively.Meanwhile, real-time PCR was used to detect the mRNA expression of ACTH releasing hormone(CRH),arginine vasopressin(AVP),vesicular glutamate transporter 2(VGluT2),glutamic acid decarboxylase 65 (GAD65),mineralocorticoid receptor(MR),glucocorticoid receptor(GR)and glutamic acid decarboxylase 67(GAD67).RESULTSIn the normal control group,UCS treatment increased the level of serum ACTH and CORT 1.96 and 3.24 times in female rats,but 1.63 and 3.54 times in male rats.In the PNE group,UCS treatment increased the level of serum ACTH and CORT 3.96 and 5.98 times in female rats,but 3.04 and 5.22 times male rats.PNE increased the mRNA expression of AVP in the female and male rats 2.04 and 1.13 times in UCS treatment control group,and the mRNA expression of hypothalamus CRH and the ratio of VGLuT2/GAD65 were increased 2.49 and 1.14 times in female rats,respectively. Furthermore,the nicotine group exhibited histological changes to different degrees in the hippocampus and dentate gyrus area of the hippocampus.In the female and male nicotine groups,the mRNA ratio of hippocampal MR/GR decreased by 88.0%and 86.0%in comparison with the normal control group without UCS,and the mRNA expression of GAD67 was enhanced 1.38 and 1.97 times in female and male rats without UCS.In the female UCS treatment nicotine groups,the mRNA expression of GAD67 was increased 2.17 times compared with the UCS treatment control group.CONCLUSIONPNE can induce a high sensibility of HPA axis in offspring rats fed with a high-fat diet.The imbalance of hippo?campus MR/GR and the enhanced expression of GAD67 mRNA may be involved.

nicotine;hippocampus;hypothalamic-pituitary-adrenal axis;high sensibility

XU Dan,E-mail:xuyidan70188@whu.edu.cn，Tel:15972228956

R99

：A

：1000-3002-（2017）01-0080-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.010

2016-08-01 接受日期：2016-11-29）

（本文編輯：喬虹）

國家自然科學基金（81220108026）；國家科學自然基金（81371483）；國家科學自然基金（81430089）

何 廈，男，碩士研究生，從事外源發育毒性研究；徐 丹，女，副教授，博士生導師，從事外源物發育毒性研究。通訊作者：徐 丹， E-mail：xuyidan70188@whu.edu.cn，Tel：15972228956

Foundation item:The project supported National Natural Science Foundation of China(81220108026);National Natural Science Foundation of China(81371483);and National Natural Science Foundation of China(81430089)