正柴胡飲對對乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷的保護作用

劉霞飛，吳 驍，楊方秀，汪玉馨，湯道權，張 玫，陸益紅

（1.徐州醫科大學院藥物分析教研室，江蘇徐州 221004；2.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇南京210008；3.中國藥科大學藥物代謝動力學重點實驗室，江蘇南京 210009）

正柴胡飲對對乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷的保護作用

劉霞飛1，2，吳 驍1，2，楊方秀1，2，汪玉馨2，3，湯道權1，張 玫2，陸益紅1，2

（1.徐州醫科大學院藥物分析教研室，江蘇徐州 221004；2.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇南京210008；3.中國藥科大學藥物代謝動力學重點實驗室，江蘇南京 210009）

目的研究正柴胡飲（ZCH）對對乙酰氨基酚（APAP）所致小鼠急性肝損傷的保護作用。方法將ICR小鼠隨機分為ZCH單次治療給藥組（0 h ig給予APAP，6 h ig給予ZCH）、ZCH多次治療給藥組（第1天ig給予APAP，第2天～第4天ig給予ZCH）、ZCH多次預防給藥組（前3天ig給予ZCH，第4天ig給予APAP）。單次治療給藥組、多次治療給藥組及多次預防給藥組均同時設正常對照組和APAP模型組（0 h ig給予APAP），單次治療給藥組同時設ZCH單獨給藥組（0 h ig給予ZCH）。APAP的給藥量為500 mg·kg-1，ZCH的給藥量以柴胡生藥計約為36 g·kg-1。每組均在末次給藥24 h后采集血漿樣本，測定血漿中谷丙轉氨酶（GPT）和谷草轉氨酶（GOT）活性，HE染色觀察肝組織病變。利用液相色譜質譜聯用技術、SIMCA及SPSS16.0軟件進行血漿代謝組學分析。結果與正常對照組相比，模型組血漿GPT和GOT酶活性均顯著升高（P＜0.01），單獨給藥組血漿GPT和GOT活性均無顯著差異；與模型組相比，單次治療給藥組、多次治療給藥組及多次預防給藥組的GPT和GOT活性顯著降低（P＜0.01），但分別與正常對照組相比仍有顯著差異（P＜0.01）。病理切片結果顯示，正常對照組和單獨給藥組均未見明顯肝損傷。與模型組相比，單次治療給藥組肝損傷面積、多次治療給藥組肝損傷面積和多次預防給藥組肝損傷程度明顯減輕。偏最小二乘辨別分析法（PLS-DA）散點圖表明，單次治療給藥組、多次治療給藥組和多次預防給藥組分別遠離APAP模型組，而向正常對照組方向移行。代謝譜結果表明，ZCH可調節由APAP引起的內源性物質變化，使其趨于正常，這些內源性物質涉及脂代謝、氨基酸代謝、糖代謝及能量代謝。結論ZCH對由APAP所致的藥源性肝損傷具有保護作用，代謝組學可靈敏、準確地預測肝損傷的發生發展，為臨床合理用藥及闡明其作用機制提供依據。

正柴胡飲；對乙酰氨基酚；藥源性肝損傷；代謝組學

對乙酰氨基酚（paracetamol，acetaminophen，APAP）為乙酰苯胺類解熱鎮痛藥，因其對普通感冒或流行性感冒引起的發熱及緩解多種疼痛有較好的療效而成為世界上銷量最大的非處方藥。其大劑量服用或多種含APAP的藥物聯合使用都有可能造成APAP過量引發毒性代謝產物大量蓄積而導致藥源性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）的發生，嚴重時可導致死亡［1］。因此，尋找防治或減輕APAP所致的肝損傷的藥物已逐漸成為人們關注的主要問題，并取得許多進展［2-4］。

約95%APAP在經Ⅱ相代謝與體內的葡萄糖醛酸等結合成大分子綴合物而排毒；當體內蓄積了大量APAP后，部分APAP在細胞色素P450酶作用下生成毒性中間代謝產物N-乙酰基-對苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI），少量NAPQI會和體內的內源性物質谷胱甘肽結合而解毒，但當體內蓄積了大量毒性產物時，體內谷胱甘肽耗竭，過量NAPQI和肝細胞中的大分子蛋白發生不可逆的共價結合而引起肝損傷［5］。Demirbas等［6］研究表明，口服APAP后可引起血清轉氨酶升高。近年研究發現，APAP的肝毒性機制和線粒體損傷及氧自由基的產生有關［7］，有學者認為是細胞內鈣離子超載、脂質過氧化反應介導APAP的肝損傷［8］。因此，重視APAP的肝毒性同時尋找能減輕或治療其引發的急性肝損傷的物質成為藥學工作者關注的一個熱點。

柴胡（Radix Bupleuri，RB）以干燥根入藥，味辛、苦，性微寒，能解表退熱，疏肝解郁，用于感冒發熱，胸脅脹痛。含有三萜及其皂苷和揮發油等成分，有解熱、鎮痛、抗菌、抗炎及抗肝損傷等功效［9］。國內曾有多篇文獻報道，用四氯化碳、乙醇及APAP制備小鼠肝損傷模型或肝癌模型，RB水提液或醇提液對肝起到明顯的保護作用，并可降低肝癌的發生率和死亡率，但機制不明確［10-14］。

“正柴胡飲（Zheng Chaihu Yin，ZCH）”為明代名醫張景岳著《景岳全書》中的解表平散代表方，由RB、陳皮、防風、赤芍藥、生姜和甘草所組成，具有發散風寒，解熱止痛的功效，主治外感風寒初起、惡寒發熱、無汗、頭痛、鼻塞、噴嚏、咽癢咳嗽和四肢酸痛等證［15］。當外感風寒發熱時，臨床常見含APAP的解熱鎮痛藥與ZCH等中成藥合用。盡管上述文獻報道了RB可減輕APAP引發的實驗動物肝損傷，但其作用機制尚不明確。這種中西藥配伍是否合理？當過量使用含APAP的解熱鎮痛藥時RB能否起到保肝作用？其作用機制是什么？這些都是亟待解決的問題，中醫藥防治作用是綜合的、整體的和動態的，因此有必要引入整體化及系統化的研究方法對ZCH肝保護作用進行綜合評價。

代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學后發展起來的系統生物學技術的一個重要分支，是研究細胞、組織或器官在受到外界微小擾動后體內內源性物質的動態變化規律，通過體內內源性物質受到外界擾動前后的差異來發現和疾病相關的潛在生物標志物。它彌補了基因組學及蛋白質組學的不足，即基因在體內不一定全部得到表達，而蛋白質在體內也不一定存在活性，基因及蛋白質的變化最終都會影響到體內的小分子內源性物質，通過給藥前后分析體內內源性物質的動態變化規律，可為疾病發生機制的闡明奠定基礎［16］。近年來，基于液質聯用、氣質聯用、核磁等代謝組學技術的發展，代謝組學已成為探尋中、西藥相互作用機制及毒性生物標志物發現的重要方法，通過有監督或無監督的模式識別方法為疾病潛在生物標志物的發掘提供了嶄新而可靠的手段，為疾病的預防、早期診斷及治療提供有效的參考依據。Sun等［17］采用液質聯用技術分析大鼠經胃APAP后尿液中和毒性相關的代謝產物并尋找到和氧化應激反應過程相關的生物標志物。

綜上所述，本課題擬采用液質聯用技術，通過研究APAP肝損傷過程中，ZCH單次、多次治療給藥及多次預防給藥后ICR小鼠代謝組學上的變化，揭示與肝損傷相關的內源性物質的種類與程度，從而探明ZCH解毒和保肝的可能作用靶點。為中藥的藥效作用整體評價以及中西藥合用的合理性提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥物和儀器

HPLC級甲酸購自美國Sigma-Aldrich公司，HPLC級乙腈購自美國Fisher公司，超純水由本實驗室Milli-Q超純水系統（Millipore，Mil-ford，MA，USA）制得。谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transami?nase，GPT）及谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）試劑盒購自浙江伊利康生物技術有限公司。ZCH水提液的制備：按照10∶10∶8∶4∶15∶7的比例稱取RB（產地：甘肅）、陳皮（產地：浙江）、防風（產地：河北）、甘草（產地：內蒙古）、赤芍（產地：安徽）和生姜（產地：山東）生藥飲片適量，浸泡30 min，首次加10倍水煎煮1.5 h，第二次加8.5倍水煎煮1.5 h，將所得藥汁水提醇沉24 h后，減壓濃縮至密度為1.25～1.30，含RB生藥3.8 kg·L-1。上述水提液由精華藥業有限公司提供（批號為20140305），收率為0.3%。APAP（化學純，含量≥98%）由國藥集團化學試劑有限公司提供。實驗時以0.5%羧甲纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）制成均勻混懸液。甜菜堿、肌酸和18種氨基酸等對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，肉毒堿和溶血磷脂膽堿等對照品由美國Sigma公司提供。

Agilent 1290超高效液相色譜儀（ultra-perfor?mance liquid chromatography，UPLC）（美國安捷倫公司），Bruker Maxis Impact quadrupole-time-offlight mass spectrometry（Q-TOF-MS）（德國布魯克公司），SIEMENS Dimension Xpand plus全自動生化分析儀（德國西門子公司），湘儀L-550臺式低速離心機（湖南湘潭離心機有限公司），Beckman Coulter Allegra 64R臺式高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司），METTLER TOLEDO十萬分之一及百萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），自動渦旋混合器ZH-2（天津藥典標準儀器廠），Thermo真空離心濃縮揮干儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 動物、分組和處理

ICR小鼠，SPF級，雄性，體質量18～22 g，由揚州大學比較醫學中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2012-0004，動物飼養于江蘇省食品藥品監督檢驗研究院屏障系統內，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0042，飼養溫度：20℃～26℃；相對濕度：40%～70%，明暗10/14 h，自由通風。給藥前禁食12 h，自由飲水。將ICR小鼠隨機分為單次治療給藥組（0 h ig給予APAP，6 h ig給予ZCH）、多次治療給藥組（第1天ig給予APAP，第2天～第4天ig給予ZCH）、多次預防給藥組（ig給予ZCH 3 d，第4天ig給予APAP）。單次治療給藥組、多次治療給藥組和多次預防給藥組均同時設正常對照組和APAP模型組（0 h ig給予APAP），單次治療給藥組同時設ZCH單獨給藥組（0 h ig給予ZCH）。各組每組10只小鼠。APAP的給藥量為500 mg·kg-1，ZCH給藥量以RB生藥計約為36 g·kg-1。各給藥組均于末次給藥24 h后于小鼠右眼內眥靜脈取血，置于EDTA抗凝管中，3000×g離心10 min，取上清。取肝，用預冷生理鹽水洗凈吸干，稱重，并肉眼觀察肝大體變化。

1.3 生化指標測定及HE染色觀察肝組織病理變化

全自動生化分析儀測定血漿中GPT和GOT活性，每組隨機選取5只動物肝于10%甲醛溶液中固定，常規病理切片，HE染色，鏡像觀察肝臟組織病理變化。

1.4 代謝組樣品制備

實驗前，取上述血漿樣品低溫解凍，各取100 μL解凍后的樣本，加入400 μL含0.1%甲酸的甲醇-乙腈溶液（體積1∶1），渦旋3 min，4℃20 000×g離心10 min，取上清液300 μL經真空離心濃縮揮干儀吹干后用150 μL含0.1%甲酸的甲醇-乙腈溶液（體積1∶1）復溶，渦旋3 min，4℃20 000×g離心10 min，取上清液100 μL進樣。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀：色譜柱為XBridgeTMAmide（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，Waters）；流速：0.2 mL·min-1；柱溫35℃；流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序為2%～35%A 0～14 min；35%～60% A 14～17 min；60%～98%A 17～22 min；98%A 22～25 min；98%～2%A 25～27 min；2%A 27～30 min。進樣量：5 μL。

1.5.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），參數設置如下：干燥氣溫度及流量：180℃，6 L·min-1。毛細管電壓：正離子模式：3800 V，負離子模式：3500 V。數據采集范圍m/z50～1000，Scan模式進行正負離子全掃描。

1.6 數據處理及統計學分析

將原始數據導入Bruker Profile Analysis軟件進行峰查找及峰校正，設置質荷比范圍m/z50～1000，質量偏差10 mu，設置修正50%缺失值，即通過50%共有峰尋找內源性代謝產物，在95%置信區間下，最終得到滿足上述條件的保留時間、質荷比及峰強度的三維數據。應用SIMCA-P16.0多變量分析軟件進行統計學分析，選擇偏最小二乘辨別分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）得到散點分布圖（scores plot）及荷載圖（loadings plot），選擇變量重要程度（variable importance in the projection，VIP）≥1的變量結合t檢驗（P＜0.05）及二級串聯質譜分析結果與HMDB及METLIN數據庫比對，尋找出潛在生物標志物。用SPSS16.0軟件采用單因素方差分析進行組間統計學分析，并進行兩兩比較，P＜0.05，P＜0.01認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZCH水提液指紋圖譜及主要成分鑒定

圖1A為ZCH水提液正離子模式下的總離子流圖，5種主要活性成分的一級質譜圖（圖1B～F），通過與標準品質譜圖比對，它們分別為RB皂苷a，b1，b2，c和d。

2.2 ZCH對APAP所致急性肝損傷小鼠血漿GPT和GOT活性的影響

2.2.1 單次治療給藥

表1結果顯示，與正常對照組相比，模型組血漿中GPT和GOT活性顯著升高（P＜0.05），說明APAP 500 mg·kg-1能明顯引起小鼠肝急性損傷。與正常對照組相比，單獨給藥組血漿中GPT及GOT活性無明顯變化，說明ZCH水提液36 g·kg-1不會引起小鼠肝損傷。與模型組相比，單次治療給藥組血漿中GPT和GOT活性均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），說明ZCH水提液單次治療能明顯緩解APAP引起的急性肝損傷。

2.2.2 多次治療給藥

表2結果顯示，與正常對照組相比，模型組血漿中GPT和GOT含量顯著升高（P＜0.01），說明APAP 500 mg·kg-1能明顯引起小鼠肝急性損傷。與模型組相比，多次治療組血漿中GPT和GOT含量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），說明ZCH水提液多次治療能緩解由APAP引起的肝毒性。

2.2.3 多次預防給藥

表3結果顯示，與正常對照組相比，模型組血漿中GPT和GOT含量顯著升高（P＜0.01），說明APAP 500 mg·kg-1能明顯引起小鼠肝急性損傷。與模型組相比，多次預防給藥組血漿中GPT和GOT含量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），說明ZCH水提液預防給藥可減輕APAP所致肝損傷。

Fig.1 Total ion chromatogram（TIC）fingerprints（A）of water extract of Zheng Chaihu Yin（ZCH）in positive ion mode and mass spectra of saikoside a（B），saikoside b1（C），saikoside b2（D），saikoside c（E）and saikoside d（F）.

Tab.1 Effect of ZCH single treatment on plasma GPT and GOT of male ICR mice administered with APAP

Tab.2 Effects of ZCH multiple treatment on plasma GPT and GOT of male ICR mice administered with APAP

2.3 ZCH對APAP所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

2.3.1 單次治療

HE染色發現（圖2），正常對照組及單獨給藥組肝組織結構完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈索狀排列，肝細胞胞核正常，胞漿貯積較多的糖原，肝細胞未見明顯的變性、壞死，肝竇無擴張充血，間充質未見炎細胞浸潤，未見纖維組織增生。模型組肝結構紊亂，肝小葉界限不清，主要發生于小葉中心，壞死肝細胞大部分呈溶解狀，有的壞死處見較多出血，偶見炎細胞浸潤。與模型組相比，單次給藥組盡管存在部分肝細胞灶性壞死，呈濃縮狀，呈溶解狀，或肝細胞見空泡變性，病變處偶見出血，但肝細胞病變程度有明顯的減輕。不同組間的肝損傷面積表明，ZCH單次給藥和APAP合用能減輕APAP所致的肝細胞病變，對APAP引起的肝毒性具有保護作用。

Tab.3 Effect of ZCH mulitiple pretreatment on plasma GPT and GOT of male ICR mice when administered 3 d prior-dosing with APAP

Fig.2 Effect of ZCH single treatment on liver pathology histology of male ICR mice administered with APAP. See Tab.1 for the treatment.The black arrow shows the necrotic hepatocyte.

2.3.2 多次治療

HE染色發現（圖3），在ZCH多次預防給藥實驗中，正常對照組與模型組結果與圖2中一致。與模型組相比，多次治療給藥組存在肝細胞灶性壞死，部分呈濃縮狀，呈溶解狀，有的肝細胞見空泡變性，但病變程度明顯減輕。各組間肝損傷面積結果表明，ZCH多次和APAP治療給藥組緩解了APAP引起的肝細胞病變程度。

Fig.3 Effect of ZCH mulitple treatment on liver patho?histology of male ICR mice administered APAP.See Tab.2 for the treatment.The black arrow shows the necrotic hepatocyte.

2.3.3 多次預防

HE染色發現（圖4），正常對照組與模型組結果與圖2中一致。與模型組相比，多次預防給藥組存在肝細胞灶性壞死，部分呈濃縮狀，呈溶解狀，或肝細胞見空泡變性，但病變程度明顯減輕。各組間肝損傷面積分析表明，ZCH多次預防給藥能減輕APAP引起的肝細胞病變。

2.4 ZCH對APAP所致急性肝損傷小鼠血漿代謝組的影響

2.4.1 單次治療

采用正離子模式對3組血漿樣品進行液質聯用分析，均得到UPLC-Q-TOF色譜圖（圖5）。

Fig.4 Effect of ZCH multiple pretretament on liver pathohistology of male ICR mice administered with 3 d prior-dosing to APAP.See Tab.3 for the treatment.The black arrow shows the necrotic hepatocyte.

采用UPLC-Q-TOF-MS對血漿樣品進行分析，原始數據通過Bruker Profile Analysis軟件共找到900多個共有峰，將這些內源性物質的豐度信息導入SIMCA-P軟件中作PLS-DA分析。從PLS-DA分析的散點圖（圖6A，R2X=0.616，R2Y=0.988，Q2=0.966）可見，模型，正常對照及單次治療給藥3組之間呈現良好的區分，單次治療給藥組與模型組之間存在一定的距離，說明肝損傷程度較模型組輕。提示ZCH能改善APAP引起的與肝毒性相關的內源性物質變化，減輕由APAP引起的肝損傷，結果與臨床生化指標及組織病理學結果一致。PLS-DA分析的載荷圖（圖6B）提示離原點越遠的點可能是潛在生物標志物。通過色譜峰強度可見，模型組與正常對照組相比、單次治療給藥組與正常對照組相比及單次治療給藥組與模型組相比，棕櫚酰組氨酸、棕櫚酰肉毒堿、十七酰肉毒堿、硬脂酰肉毒堿、鞘氨醇、磷酸絲氨酸〔phos?phatidylserine，PS（40∶1）〕、膽堿、磷脂酰乙醇胺〔phosphatidyl ethanolamine，PE（19∶1）〕、溶血卵磷脂〔Lysophosphatidylcholine，LPC（14∶0）〕、1-磷酸葡萄糖及精氨酸的變化有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）（圖7）。

Fig.5 Effect of ZCH single treatment on plasma metabo?lomics total ion chromatorgraphys（TIC）profiles of male ICR mice by ultra-performance liquid chromatography/ quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOFMS）in positive mode.See Tab.1 for the treatment.

Fig.6PLS-DA score plots（A）and loadings plots（B）by UPLC-Q-TOF-MS in positive mode of ZCH single treatment on plasma metabolomics of male ICR mice.See Tab.1 for the treatment.

Fig.7Changes in chromatographic peak intensity of endogenous substances related to lipid metabolism，amino acid metabolism and energy metabolism in mouse plasma.See Tab.1 for the treatment.n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.4.2 多次治療

采用正離子模式對3組血漿樣品進行液質聯用分析，均得到UPLC-Q-TOF色譜圖（圖8）。

PLS-DA分析的散點圖（圖9A，R2X=0.739，R2Y= 0.915，Q2=0.556）可見，模型組獨立分布在第三象限，正常對照和多次治療給藥組之間有一定的重合區域，表明多次治療給藥組已向正常對照組趨近，有減輕APAP肝損傷的趨勢。PLS-DA分析的載荷圖（圖9B）提示離原點越遠的點可能是潛在生物標志物。通過色譜峰強度可見，模型組與正常對照組相比、多次治療給藥組與正常對照組相比及多次治療給藥組與模型組相比，PC和PE及脯氨酸的變化有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）（圖10）。

2.4.3 多次預防

采用正離子模式對3組血漿樣品進行液質聯用分析，均得到UPLC-Q-TOF色譜圖（圖11）。

從PLS-DA分析的散點圖（圖12A，R2X=0.658，R2Y=0.984，Q2=0.961）可見，模型、正常對照及多次預防給藥組呈現了良好的區分度。PLS-DA分析的載荷圖（圖12B）提示離原點越遠的點可能是潛在生物標志物。通過色譜峰強度可見，模型組與正常對照組相比、多次預防給藥組與正常對照組相比及多次預防給藥組與模型組相比，植物鞘氨醇、乙酰膽堿、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、PE、肌酸、丙氨酸、1-磷酸葡萄糖及甘油磷酰膽堿的變化有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）（圖13）。

Fig.8 Effect of ZCH multiple treatment on plasma metabolomics TIC profiles of male ICR mice plasma by UPLC-Q-TOF-MS in positive ion mode.See Tab.2 for the treatment.

Fig.9 PLS-DA score plots（A）and loadings plots（B）of ZCH multiple treatment on plasma metabolomics of male ICR mice by UPLC-Q-TOF-MS in positive mode.See Tab.2 for the treatment.

Fig.10Changes in chromatographic peak intensity of endogenous substances related to lipid metabo?lism，amino acid metabolism and energy metabolism in mouse plasma.See Tab.2 for the treatment.n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Fig.11Effect of ZCH multiple pretreatmnet on plasma metabolomics TIC profiles of male ICR mice by UPLC-QTOF-MS in positive ion mode.See Tab.3 for the treatment.

Fig.12 PLS-DA score plot（A）and loadings plot（B）of ZCH multiple pretreatment on plasma of male ICR mice by UPLC-Q-TOF-MS in positive mode.See Tab.3 for treatment.

Fig.13 Changes in chromatographic peak intensity of endogenous substances related to lipid metabolism，amino acid metabolism and energy metabolism in mouse plasma.See Tab.3 for the treatment.x±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

ZCH單次及多次與APAP聯合用藥，從血漿GPT及GOT水平和肝組織病理學變化可見有明顯保護APAP肝損傷的作用，通過代謝組學數據的統計分析和研究，從體內近千個內源性代謝物的分析也可發現ZCH有改善APAP所致肝損傷的趨勢。血漿代謝組學的研究結果發現，ZCH的保肝作用涉及改善脂質代謝、氨基酸代謝及能量代謝過程。在3種給藥方式中，單次治療給藥組、多次預防給藥組與正常對照組有顯著差異的標志物數量相當，但種類有所不同，多次治療給藥組改善數量最少。相同種類的化合物均涉及PC和PE，ZCH單次與APAP聯合用藥對肉毒堿類化合物的改善更為顯著。

在脂質代謝通路中，APAP模型組中多種PC水平升高表明線粒體膜的損傷及磷脂膽堿體內代謝過程的紊亂，PC峰強度增大與肝壞死及GPT和GOT活性的升高有密切的關系，這與文獻［8］報道相符。肝細胞的磷脂酶模型組被APAP激活而水解成PC，PC的蓄積使肝細胞膜溶解，細胞膜溶解后因其通透性增加而引發轉氨酶入血，最終引起GPT和GOT的升高。涉及脂肪酸β-氧化過程中的十七酰肉毒堿、棕櫚酰肉毒堿及硬脂酰肉毒堿在APAP模型組中的含量明顯高于正常對照組。McGill等［18］研究發現，過量服用APAP后，肉毒堿含量上調，與本研究結果一致。但也有文獻報道，在肝損傷過程中肉毒堿含量下降［19］，推測可能是因為肉毒堿類物質在體內的平衡狀態處于一定的范圍，其含量過高或過低都極易打破其平衡，導致肝疾病的發生。

在氨基酸代謝環節中，APAP模型組棕櫚酰組氨酸含量升高，可能是因為組氨酸是谷氨酸合成的前體物質，谷氨酸可通過氧化脫氨作用生成α-酮戊二酸進入TCA循環，ZCH通過下調棕櫚酰組氨酸的含量維持TCA循環的穩態而發揮作用。丙氨酸在體內經血液運輸到肝，通過聯合脫氨作用釋放出氨來合成尿素，這是肝細胞的一種重要的生物學功能，由于APAP模型組丙氨酸含量升高，導致肝內合成尿素受阻，從而引發肝損傷。

1-磷酸葡萄糖是肝細胞線粒體糖酵解過程中的重要原料，肝糖原在糖原磷酸化酶的作用下生成1-磷酸葡萄糖，1-磷酸葡萄糖進而在磷酸葡萄糖變位酶的作用下生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖最終經一系列反應生成丙酮酸完成整個糖酵解過程［20］。ZCH通過上調1-磷酸葡萄糖的含量恢復肝細胞線粒體的功能狀態，使糖酵解過程得到恢復，進而減輕肝毒性。

給藥組中的膽堿及乙酰膽堿含量與APAP模型組比較呈現下調的趨勢。乙酰膽堿作為體內的一種神經遞質，能特異性地作用于膽堿受體。郭燕等［21］采用Wistar大鼠誘導肝纖維化模型，研究和絡舒肝膠囊對模型組肝乙酰膽堿受體的影響探討其抗肝纖維化的機制，通過聚合酶聯反應結合免疫印跡的方法發現模型組中乙酰膽堿的含量明顯高于正常對照組，這與本實驗結果相符，其機制可能與其促進肝星狀細胞的增殖分化密切相關［22］。膽堿是合成乙酰膽堿的前體，乙酰膽堿可在膽堿酯酶的作用下水解成膽堿，體內模型組乙酰膽堿含量的升高導致了模型組膽堿的含量升高。

本研究表明，代謝組學技術手段與血生化指標及病理切片分析方法相比有明顯的優勢，通過血漿樣本代謝組學分析發現與肝損傷相關的生物標志物，可從整體上闡明ZCH對藥源性肝損傷的保護機制，可能為探索藥物在體內相互作用靶點提供一條新的研究途徑。

致謝：感謝本院譚力老師對本研究的指導，感謝江蘇省安評中心白文霞老師對本研究提供的幫助。

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Protective effect of Zheng Chaihu Yin on paracetamol induced acute liver injury of mice

LIU Xia-fei1，2，WU Xiao1，2，YANG Fang-xiu1，2，WANG Yu-xin2，3，TANG Dao-quan1，ZHANG Mei2，LU Yi-hong1，2

（1.Department of Pharmacautical Analysis，Xu zhou Medical Vniversity，Xuzhou 221004，China；2.Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210008，China；3.China Pharmaceutical University，Nanjing 210008，China）

OBJECTIVETo explore the effect of aqueous extract ofZheng Chaihu Yin（ZCH）on paracetamol（acetaminophen，APAP）-induced hepatotoxicity.METHODSMale ICR mice were dividedinto three scenarios randomly：the single treatment dose of ZCH，multiple treatment or pretreatment dose of ZCH.Each scenario had a up control group and an APAP model group，while single treatment dose of ZCH group had a ZCH group at the same time.The dose of APAP and ZCH was 500 mg·kg-1and 36 g·kg-1，respectively.24 h after the last administration，plasma and liver samples were prepared.Ultra-performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS）based metabolomics profiling was used to examine changes in plasma after expo?sure to ZCH，APAP or co-exposure to ZCH and APAP.Glutamic pyruvic transaminase（GPT）and glutamic oxaloacetic transaminas（GOT）values were determined by a biochemical auto analyzer in plasma.Histopathologic changes in the liver were observed and the area was calculated after HE staining. The data were analyzed with SPSS16.0 statistical software and the results were compared with the test between the two groups to find biomarkers.Also，SIMCA software was used for partial least squares-discriminant analysis（PLS-DA）pattern recognition.RESULTSCompared to control group，APAP dosing alone caused an increase in plasma transaminases and alterations in multiple metabolic pathways.Compared to APAP group，decrease in plasma transaminases was noted when ZCH was administered after or prior to APAP.Histopathologic results showed that in the single treatment group，multiple treatment group and pretreatment group，ZCH could alleviate the liver damage induced by APAP from（32.3±12.0）%to（14.2±9.9）%，（8.6±7.9）%to（5.2±1.7）%and（32.5±10.0）%to（5.2±6.4）%（P＜0.05）.Similarly，the PLS-DA of the LC-MS data showed that the groups dosed with APAP alone were the most distinct from controls，while animals dosed with ZCH prior to or after APAP treatment were located near control group.Metabolic spectrum results showed that ZCH could restore the changes in endogenous substances including lipid metabolism，amino acid metabolism，sugar metabolism and energy metabolism induced by APAP to normal.CONCLUSIONZCH water-extraction plays major roles in the regulation of metabolism on APAP-induced liver injury.These studies demonstrate that UPLCQ-TOF-MS-based metabolomic analysis can be sensitively and accurately predict the initiation and progres?sion of liver injury and greatly contribute to a better understanding of the hepatoprotective effects of ZCH in a clinical environment.

Zheng Chaihu Yin；paracetamol；drug-induced liver injury；metabolomics

LU Yi-hong，E-mail：yihonglu@163.com，Tel：（025）86633622

R285

A

1000-3002-（2017）01-0101-11

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.013

2016-01-05接受日期：2016-09-05）

（本文編輯：沈海南 賀云霞）

國家科技重大專項（20152X09303001）

劉霞飛，女，碩士，主要從事體內藥物分析及藥品安全性研究；陸益紅，女，博士，主任藥師，主要從事藥物分析及藥品安全性評價。

陸益紅，E-mail：yihonglu@163.com，Tel：（025）86633622

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project of China（20152X09303001）