美洲紅點鮭嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗

巴翠玉，張雅斌，杜曉燕，張林波，趙福廣，張培軍，李月紅

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118;2．吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林長春130033; 3．吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，吉林長春130000)

美洲紅點鮭嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗

巴翠玉1，張雅斌2，杜曉燕2，張林波1，趙福廣1，張培軍3，李月紅1

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118;2．吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林長春130033; 3．吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，吉林長春130000)

為預(yù)防和治療在美洲紅點鮭中暴發(fā)嗜水氣單胞菌病提供實驗依據(jù)。從患病美洲紅點鮭的鰓及腸等病灶部位分離到一株細(xì)菌，經(jīng)回歸試驗均出現(xiàn)與自然病例相似的癥狀，并分離到革蘭染色和生理生化特性結(jié)果與原菌株相同的細(xì)菌。結(jié)果表明，該菌為短桿狀，兩端鈍圓的革蘭陰性菌，與D－葡糖酸、丙二酸和葡萄糖等反應(yīng)呈陽性，而與黏菌素、七葉苷和L－阿拉伯糖等反應(yīng)呈陰性，結(jié)合16S rRNA基因序列分析結(jié)果，該菌與嗜水氣單胞菌的親緣關(guān)系最近，鑒定為嗜水氣單胞菌。對其進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果對氨芐西林、環(huán)丙沙星和頭孢唑啉等藥物表現(xiàn)出耐藥，對阿米卡星和亞胺培南等藥物敏感。本試驗首次從美洲紅點鮭中分離出嗜水氣單胞菌，并得到16種高度敏感的藥物，同時闡明了嗜水氣單胞菌在美洲紅點鮭中的發(fā)病癥狀。

美洲紅點鮭;嗜水氣單胞菌;分離鑒定;藥敏試驗

美洲紅點鮭，俗稱七彩鮭，屬鮭形目、鮭科、紅點鮭屬，主要分布在加拿大東部和美國東北部的大部分水域，2001年引進(jìn)我國［1－2］。因具有生長速度快、產(chǎn)量高、抗病能力強(qiáng)、肉質(zhì)好等特點，在我國被許多地方養(yǎng)殖。關(guān)于紅點鮭屬魚類的研究主要針對于生物學(xué)、人工繁殖和苗種培育、成魚養(yǎng)殖等方面［3］，對于疾病方面的研究較少，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模及數(shù)量的不斷增加，魚病的暴發(fā)率也不斷升高，尤其是細(xì)菌性疾病病發(fā)率更高，給養(yǎng)殖戶帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。因此，加強(qiáng)對病害的檢測，隨時掌握病害發(fā)生情況，迅速制定有效的防控措施，對養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。2015年10月，吉林省某漁場的美洲紅點鮭發(fā)生了爛鰓病，魚發(fā)病后死亡率較高。本試驗對發(fā)病美洲紅點鮭進(jìn)行了病原菌的分離鑒定，分離到一株嗜水氣單胞菌，經(jīng)回歸試驗證實該菌株具有較強(qiáng)致病力，通過形態(tài)特征、主要理化特性及分子生物學(xué)手段等對該菌進(jìn)行鑒定，同時對病原菌進(jìn)行藥物敏感性試驗，為預(yù)防和治療嗜水氣單胞菌引起的鮭科類疾病提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 美洲紅點鮭來源自然患病的美洲紅點鮭采自吉林省某漁場，均尾重約600 g左右;人工感染用的健康美洲紅點鮭由青龍養(yǎng)殖場提供，均尾重約300 g左右。

1．2 發(fā)病特征患病魚肛門紅腫，體表完整在水中不集群，游動緩慢，魚體上浮，攝食量明顯下降;鰓蓋向外張開，呈鑷子狀，各鰭末端色素減退，呈淺白色;剖檢發(fā)現(xiàn)，鰓絲腫脹，末端部分糜爛，周圍帶有黏液，鰓絲呈灰褐色、“掃帚狀”;膽囊腫大呈墨綠色;后腸充血，腸腔無內(nèi)容物，含淺黃色的黏液，腸壁黏膜呈現(xiàn)紫紅色。

1．3 試驗儀器及試劑150G全溫振蕩培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、超凈工作臺、革蘭染色試劑盒、法國梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、生理鹽水、酶等。

1．4 方法

1．4．1 病原菌的分離與培養(yǎng)在無菌的超凈工作臺內(nèi)將具有典型自然發(fā)病癥狀的瀕死美洲紅點鮭，用75%酒精棉球擦拭體表，無菌操作取其鰓和腸等病灶部位并制成勻漿，接種到麥康凱瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長狀態(tài)。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群進(jìn)行純培養(yǎng)，待菌落形態(tài)生長一致時，挑取單菌落用80%甘油對其進(jìn)行菌落的保藏，為后續(xù)試驗做準(zhǔn)備。

1．4．2 病原菌的鑒定

1．4．2．1 細(xì)菌形態(tài)觀察將分離菌接種于培養(yǎng)基平板上，置于28℃培養(yǎng)12 h，取菌體涂片，革蘭染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征。

1．4．2．2 生化鑒定用法國梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行對其鑒定，鑒定板為革蘭陰性菌鑒定板，結(jié)合生物梅里埃公司的API－細(xì)菌鑒定系統(tǒng)API20E進(jìn)行生化反應(yīng)測試。試驗周期結(jié)束后觀察試驗結(jié)果并分析。

1．4．2．3 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

PCR模板DNA制備，按照文獻(xiàn)［4］所示方法提取細(xì)菌DNA，利用Primer 5軟件設(shè)計擴(kuò)增16S rRNA基因所用引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其上、下游引物序列分別為:P1:5'－GAGGAGGAAAGGTTGATGCC－3'，P2:5'－CTTGAGTTCCCACCATTACG－3'。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為: DNA模板3 μL，10×PCR Buffer 2．5 μL，DNTP mix 1．5 μL，上、下游引物各1μL，MgCl20．5 μL，Taq DNA聚合酶0．5 μL，DEPC水補(bǔ)充至25 μL。PCR程序為:94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后連接入pMD18－T載體，挑選陽性克隆交由華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。將所得分離菌株的16S rRNA序列在GenBank中進(jìn)行BIAST比對，通過Mega5．0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．4．2．4 藥物敏感試驗用法國梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗，鑒定板為革蘭氏陰性菌藥敏板，試驗周期結(jié)束后觀察試驗結(jié)果并分析。

1．4．2．5 回歸試驗試驗魚購自青龍養(yǎng)殖場，選用當(dāng)年的美洲紅點鮭。15℃水溫下馴化7 d，選取體格健壯、規(guī)格整齊、游動活躍的美洲紅點鮭60尾，隨機(jī)分為2組，其中1組為對照組，另1組為試驗組。將2組魚同時放入相同水環(huán)境不同魚缸中。通過腹腔注射法進(jìn)行攻毒，對照組每條魚注射無菌液體LB培養(yǎng)基0．2 ml，試驗組每條魚注射菌液濃度為1×107CFU/mL的液體LB培養(yǎng)基0．2 ml。15℃水溫下飼養(yǎng)7 d，觀察美洲紅點鮭發(fā)病狀況，并記錄。后再對病死美洲紅點鮭進(jìn)行病原菌的分離及鑒定。

2 試驗結(jié)果

2．1 病原菌分離及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果從發(fā)病美洲紅點鮭的病灶部位分離出1株菌株，命名為MZ－1，28℃培養(yǎng)24 h，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形、光滑濕潤、邊緣整齊、中央微隆起、半透明、乳白色。顯微鏡下可以觀察到顏色為紅色短桿狀，兩端鈍圓，多數(shù)單個排列，少數(shù)成對或短鏈狀，為革蘭陰性菌。

2．2 生化鑒定結(jié)果MZ－1經(jīng)過法國梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，可知與蔗糖、D－葡萄糖和D－甘露糖等21項指標(biāo)反映呈陽性，與側(cè)金盞花醇、組氨酸同化和D－纖維二糖等27項指標(biāo)反映呈陰性，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)，確定菌株為嗜水氣單胞菌。

2．3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果16S rRNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果如圖1，分離菌(MZ－1)所擴(kuò)增的16S rRNA基因長度為1 500 bp;經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)菌株與嗜水氣單胞菌的親緣關(guān)系最近，自然聚類為一支，菌株為嗜水氣單胞菌。

圖1 MZ－1菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果(2－a)和16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析(2－b) M:DL-2 000 DNA Marker;1和2為PCR產(chǎn)物

2．4 藥物敏感試驗結(jié)果經(jīng)過法國梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表1，藥敏試驗判定參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會VET01－A4標(biāo)準(zhǔn)［5］，這株菌對氨芐西林和氨芐青霉素/舒巴坦等藥物表現(xiàn)出耐藥，對哌拉西林、頭孢呋辛及其他14種藥物敏感。

表1 藥敏試驗結(jié)果

2．5 回歸試驗結(jié)果結(jié)果如表2，分離菌株注射感染24 h后，美洲紅點鮭開始食量下降，游動緩慢。36 h后開始出現(xiàn)死亡。7 d后，對照組一切正常，沒有發(fā)現(xiàn)死亡;注射菌液濃度為1×107CFU/mL液體LB培養(yǎng)基0．2ml的試驗組中美洲紅點鮭的死亡率為80%。從試驗組隨機(jī)挑取一條魚剖檢發(fā)現(xiàn)，鰓蓋向外張開，呈鑷子狀，各鰭末端色素減退，呈淺白色;剖檢發(fā)現(xiàn)，鰓絲腫脹，末端部分糜爛，周圍帶有黏液，鰓絲呈灰褐色、“掃帚狀”;膽囊腫大呈墨綠色;后腸充血，腸腔無內(nèi)容物，含淺黃色的黏液，腸壁黏膜呈現(xiàn)紫紅色。取其腸和鰓等病灶部位進(jìn)行細(xì)菌的再分離，對分離出的菌株進(jìn)行革蘭染色和生理生化鑒定，結(jié)果同從自然發(fā)病魚體分離的株菌完全一致為嗜水氣單胞菌，證明嗜水氣單胞菌是該次疾病的病原菌。

表2 回歸試驗結(jié)果

3 討論

本試驗首次從發(fā)病美洲紅點鮭的鰓和腸等病灶部位分離出1株嗜水氣單胞菌。主要癥狀表現(xiàn)為體表完整，肛門紅腫，鰓蓋向外張開、呈鑷子狀，各鰭末端色素減退，呈淺白色;剖檢發(fā)現(xiàn)，鰓絲腫脹，末端部分糜爛，周圍帶有黏液，鰓絲呈灰褐色、“掃帚狀”;膽囊腫大呈墨綠色;病魚后腸充血，腸腔無內(nèi)容物，含淺黃色的黏液，腸壁黏膜呈現(xiàn)紫紅色。此癥狀與楊斌［6］發(fā)表的虹鱒爛鰓病病原調(diào)查報告中癥狀相似。但除了常規(guī)的革蘭染色、生理生化鑒定，PCR等常規(guī)的細(xì)菌檢測方法外，我們還可以用免疫學(xué)方法對其進(jìn)行檢測，如凝集試驗、免疫熒光試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等。

對這株菌進(jìn)行藥敏試驗，通過藥物敏感試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離出的嗜水氣單胞菌對美羅培南和阿米卡星等藥物高度敏感，對氨芐西林和環(huán)丙沙星等藥物表現(xiàn)出耐藥，此結(jié)果與毛海濤［7］等從錦鯉分離出來的致病性嗜水氣單胞菌藥敏試驗結(jié)果有些差異。可能是因嗜水氣單胞菌存在很多血清型，不同魚種間分離的致病菌株存在明顯差異，即使相同魚種也存在不同耐藥性菌株，而且細(xì)菌基因組上的堿基突變、片段插入或缺失、等位基因缺失等變化都可能引起細(xì)菌耐藥性的改變［8－9］。還有研究表明，外毒素、胞外蛋白酶、S層蛋白和脂多糖等這些致病因子可以受到嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，信號分子主要是C4－HSL和C6－HSL［10－11］。因此，通過抑制致病菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)而抑制其致病因子的表達(dá)將成為控制致病菌的新型治療手段［12］。中草藥和微生態(tài)制劑因具備不易殘留和不易引起耐藥性等優(yōu)點而作為防治水產(chǎn)動物疾病的藥物［13－14］，因此在水產(chǎn)病害防治中有必要加大在中草藥和微生態(tài)制劑方面的投入，開發(fā)具有高效、無副作用和便捷的復(fù)方中草藥以及免疫效果好、成本低并且適于批量生產(chǎn)的生物疫苗，真正發(fā)揮中草藥和微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病防治中的重要作用。

隨著美洲紅點鮭人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，疾病暴發(fā)也頻繁起來。因嗜水氣單胞菌致美洲紅點鮭發(fā)病的研究較少，一些具體的發(fā)病機(jī)制和毒力基因等方面的研究仍需要進(jìn)一步的探究，本試驗對吉林省嗜水氣單胞菌感染美洲紅點鮭發(fā)病的治療提供了一定的試驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)，對其養(yǎng)殖具有一定的指導(dǎo)，可為后面的研究提供一定的參考。

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Isolation，identification and drug sensitive test of Aeromonas hydrophil from Salvelinus fontinalis Crucian Carp

BA Cui-yu1，ZHANG Ya-bin2，DU Xiao-yan2，ZHANG Lin-bo1，ZHAO Fu-guang1，ZHANG Pei-jun3，LI Yue-hong1
(1．Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;2．Freshwater Fisheries Research Institute of Jilin Province，Changchun 130033;3．Jilin Province Health Surveillance Inspection Center，Changchun 130000，China)

One strain of bacteria was isolated from the lesion of gill and viscera of the diseased Salvelinus fontinalis．After artificial injection with the bacterial suspensions，the healthy Salvelinus funtinalis showed the symptoms similar to those in natural disease．Another strain of the same pathogen was isolated from diseased fry caused by artificial infection．The results showed that the bacteria were short and rounded at both ends．the bacteria were gram negative，D－glucose－positive，malonic acid－positive，glucose－positive，colistin－negative，esculin－negative，and L-Arabinose－negative．This bacteria with the 16S rRNA gene sequence analysis showed that the bacterium was most closely related to Aeromonas hydrophil，and the strain was identified as Aeromonas hydrophil．The antibiotic sensitivity analysis showed that bacteria strain was resistant to ciprofloxacin，ampicillin，and cefazlin and sensitive to amikacin，and imipenem．In conclusion，we demonstrated that the bacterium was Aeromonas hydrophil，and drug sensitivity identified some kinds of drugs which were highly sensitive to the bacterium．

Salvelinus fontinalis;Aeromonas hydrophil;isolation and identification;drug sensitivity test

LI Yue－h(huán)ong

S943

A

0529-6005(2017)01-0096-04

2016－05－03

國家自然科學(xué)基金(30972191);吉林省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(201506);吉林省留學(xué)回國人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201523)

巴翠玉(1992－)，女，碩士，主要從事分子病原微生物學(xué)與分子免疫學(xué)研究，E－mail:bacuiyu@163．com

李月紅，E－mail:liyhong@sina．com