黃芪發酵菌的篩選鑒定及纖維素酶學性質試驗

(黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江齊齊哈爾161006)

黃芪發酵菌的篩選鑒定及纖維素酶學性質試驗

王巖，劉宇，侯美如，尹珺伊，朱慶賀，秦平偉，史同瑞

(黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江齊齊哈爾161006)

為分離發酵黃芪菌株，試驗采取黃芪樣品接種營養瓊脂，置30℃環境培養。取分離菌接種纖維素剛果紅瓊脂，篩選能形成較大降解圈的細菌進行鑒定，并測定其纖維素酶性質。結果表明，篩選菌為解淀粉芽孢桿菌，該菌株降解圈直徑(H)與菌落直徑(C)的比值(H/C)為4.03。在37℃環境培養36 h酶活力達到高峰，為32.16 U/mL。在低于60℃及pH值6.0～8.0環境纖維素酶較穩定，可保持酶活力90%以上。

黃芪;中藥發酵;纖維素酶;解淀粉芽孢桿菌

現代中藥發酵技術是結合現代生物工程學、微生態學、發酵工程學等學科技術，在中藥傳統發酵炮制方法的基礎上發展形成的現代中藥制藥新技術。中草藥細胞壁是由纖維素、半纖維素和木質素等成分構成的致密結構，有效成分大多包裹在細胞壁內。應用煎煮等傳統方法提取中藥時，胞內有效成分向提取介質中擴散需要克服細胞壁及細胞間質的雙重阻力，有效成分不易游離至提取介質中。應用降解纖維素的微生物發酵中藥，微生物分泌的纖維素酶可裂解細胞壁纖維，有利于中藥有效成分向胞外釋放，提高中藥的提取率［1］。

源于細菌的纖維素酶不僅具有耐堿、耐熱等優良特性，而且細菌生長周期短，發酵工藝簡單，易于控制，因此產纖維素酶細菌研究廣受重視［2－3］。由于產纖維素酶芽孢桿菌具有抗逆性強、易于產業化等優點，因而更具應用前景。本試驗從黃芪樣品中分離篩選出1株產纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌，并測定了酶學特性，以期用于黃芪的生物發酵。

1 材料與方法

1．1 藥材與試劑黃芪，購自河北凱達藥業有限公司;TaKaRa Mini BEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver．3．0、EX Taq酶和dNTP，均購自大連寶生物工程有限公司;Marker DL－2000，購自Genstar公司;瓊脂糖，購自OXOID公司。

1．2 培養基黃芪瓊脂:黃芪粉100 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，牛肉湯1 000 mL，pH值7.2。發酵培養基:羧甲基纖維素鈉10 g，葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7．2。

1．3 DNS試劑參照文獻［4－5］，稱取3，5－二硝基水楊酸6．3 g溶于約700 mL蒸餾水中，然后加入0.2 g/mL氫氧化鈉溶液100 mL，攪拌均勻，依次加入四水酒石酸鉀鈉182 g、苯酚5 g、無水硫酸鈉5 g，溶解后用蒸餾水定容至1 000 mL。

1．4 黃芪發酵菌篩選取黃芪樣品接種營養瓊脂，置30℃環境培養。取生長菌接種黃芪瓊脂、點種纖維素剛果紅瓊脂，置30℃環境培養，篩選能在黃芪瓊脂生長，并在剛果紅培養基形成較大降解圈的細菌。測量篩選菌水解透明圈直徑(H)與菌落直徑(C)的比值(H/C)，初步判定篩選菌降解纖維素的活力［6－7］。

1．5 分子生物學鑒定按DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA。應用細菌通用引物擴增16S rRNA，P1:5'－GAGCGGATAACAATTTCACACAGG－3'; P2:5'－CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC－3'。PCR反應體系50 μL，其中TaqDNA聚合酶0．5 μL、10×PCR reaction Buffer 5 μL，模板DNA 2 μL，dNTP為1 μL，上下游引物各2 μL，去離子水補至50 μL。擴增條件:94℃預變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火復性40 s，72℃延伸2 min，35個循環，72℃延伸10 min。擴增產物于0．8%瓊脂糖凝膠檢測后測序。利用NCBI－BLAST搜索程序從GenBank進行同源性檢索，并構建系統進化樹。

1．6 葡萄糖標準曲線繪制取試管分別加入1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，再依次加入蒸餾水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6 mL，然后各管加DNS試劑2 mL，置沸水浴5 min。以對照調零，于490 nm處測定各管OD值。以標準葡萄糖溶液的葡萄糖含量(mg)為橫坐標，以OD值為縱坐標，作葡萄糖標準曲線。

1．7 纖維素酶學性質測定

1．7．1 產酶曲線測定參照文獻［7－12］方法測定酶活力。在菌株發酵培養18～72 h，每隔6 h取樣1次，測定發酵液中纖維素酶酶活力。以時間為橫軸，以纖維素酶活力為縱軸繪制曲線，即得該菌產酶曲線。

1．7．2 熱穩定性測定取試管分別加入發酵液3 mL，試驗管分別置20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃環境，對照管置室溫環境，作用1 h后測定相對酶活力，纖維素酶穩定性以存余酶活力與對照酶活力的百分率表示。

1．7．3 酸堿穩定性測定取試管分別加入發酵液3 mL，用2 mol/L鹽酸或氫氧化鈉分別調各管發酵液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，對照管不作處理，置30℃環境作用1 h，各管用檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液調至9 mL，然后測定相對酶活力，計算剩余酶活力的百分率。

2 結果與分析

2．1 菌株篩選結果從黃芪樣品中篩選出1株能在黃芪瓊脂生長，且在剛果紅瓊脂形成較大降解圈的細菌，菌株H/C為4.03，據此判斷該菌株降解纖維能力較強。

2.2 PCR擴增及系統進化樹分析以菌株總DNA為模板，采用16S rRNA引物P1、P2進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增獲得目的片段約500 bp，結果如圖1。

圖1 目的基因PCR擴增結果M:DL－2 000DNA Marker;1、2:PCR產物;3:陰性對照

擴增序列長度為574 bp，經BLAST與GenBank數據庫序列比對，該序列與解淀粉芽孢桿菌IHBB2284及MD33同源性達100%。同時構建系統進化樹，見圖2。結果表明，篩選菌株與解淀粉芽孢桿菌IHB B2284株及MD33株在同一分支中，確定該菌為解淀粉芽孢桿菌，并命名為解淀粉芽孢桿菌SSY1株。

圖2 菌株16S rRNA基因系統進化樹

2．3 葡萄糖標準曲線依據不同含量葡萄糖溶液在波長490 nm處測定的OD值，得回歸方程y= 0.8651x－0．0323，相關系數R2=0.9992，葡萄糖標準曲線見圖3。

2．4 酶學性質

2．4．1 不同培養時間纖維素酶活力不同培養時間發酵液的纖維素酶活力曲線見圖4。在菌株發酵培養36 h纖維素酶活力達到最大值，為32.16 U/mL，此后至培養72 h，纖維素酶活力呈平穩波動狀態。見圖4。

圖3 葡萄糖標準曲線

圖4 酶活力測定結果

2．4．2 纖維素酶熱穩定性將發酵液分別置不同溫度環境作用1h，酶活力測定結果見圖5。在低于60℃環境中纖維素酶較為穩定，酶活力均維持在最高酶活力的90%以上。當溫度高于60℃時纖維素酶活力失活加劇，當溫度為80℃時，纖維素酶活力下降至最高酶活的30%以下。

圖5 熱穩定性測定結果

2．4．3 纖維素酶酸堿穩定性將發酵液分別置不同酸堿度的環境中作用1h，酶活力測定結果見圖6。纖維素酶力在pH值7．0最穩定，相對酶活力為99.51%，在pH值6.0～8.0環境纖維素酶具有較好穩定性，相對酶活力保持在90%以上，在pH值3.0環境最不穩定，相對酶活力僅為22.15%。

圖6 酸堿穩定性測定結果

3 討論

中藥生物發酵是現代中藥炮制領域的研究熱點，選育優良發酵菌種是發酵中藥的技術關鍵。目前用于發酵黃芪的菌種主要有保加利亞乳桿菌、乳酸菌、香菇真菌、靈芝真菌、傘枝犁頭霉菌和糙皮側耳菌等［14－15］。本試驗從黃芪樣品中分離出一株具有降解纖維能力，能在黃芪培養基生長的細菌，經形態及分子生物學鑒定為解淀粉芽孢桿菌。該菌株營養要求低，適應性強，安全性良好，有望作為發酵黃芪的候選菌株。

DNS方法是測定纖維素酶活力的常用方法，具有操作簡便，精確度較高等優點，但易受酶力和底物濃度等條件的影響［1，9］。本試驗分離的解淀粉芽孢桿菌所產纖維素酶活力為32.16 U/mL，與李紅亞等［16］報道的解淀粉芽孢桿菌產纖維素酶活力45.4 U/g較近，而遠低于崔海洋等［17］報道的解淀粉芽孢桿菌菌株所產纖維素酶活力307.23 U/mL，以及王凱等［18］報道的纖維素酶酶活力135.8 U/mL。由于DNS方法中纖維素濃度、反應體系加量，以及測定波長的差異性，因此各學者測定的結果可比性也不強。依據篩選菌在剛果紅培養基形成的降解圈，初步判斷該菌株具有中等降解纖維素活力［6－7，18］。

目前，用于發酵中藥的菌種主要為細菌和食用真菌，本試驗分離的解淀粉芽孢桿菌在室溫條件下能在含黃芪的培養基上正常生長，且安全性良好，這為應用本菌發酵黃芪奠定了一定的技術基礎。

［1］康紀婷，吳翔，甘炳成，等．纖維素酶活力測定方法［J］．河北農業科學，2010，14(4):151－153．

［2］程仕偉，李坦坦，梁會會．響應面優化金橙黃微桿菌YT9的發酵條件生產纖維素酶［J］．中國釀造，2013，32(4):48－51．

［3］Jorgensen H，Morkeberg A，Krogh K B R，et al．Growth and en? zyme production by three Penicillium species on monosaccharides［J］．Journal of Biotechnology，2004，109:309－313．

［4］天津輕工業學院，大連輕工業學院，無錫輕工業學院，等．工業發酵分析［M］．北京:中國輕工業出版社，2004:595－623．

［5］王義甫，何艷玲，孔令娜．飼用纖維素酶測定方法的探討［J］．新飼料，2007，02:33－35．

［6］吳琳，景曉輝，黃俊生．產纖維素酶菌株的分離、篩選及酶活性測定［J］．安徽農業科學，2009，37(17):7855－7857．

［7］楊婕，葉秀云，嚴芬，等．產高溫纖維素酶木霉菌株的篩選、鑒定及酶學性質研究［J］．中國生物工程雜志，2012，32(7):60－65．

［8］王琳，劉國生，王林嵩，等．DNS法測定纖維素酶活力最適條件研究［J］．河南師范大學學報(自然科學版)，1998，26(3):66－69．

［9］趙玉萍，楊娟．四種纖維素酶酶活測定方法的比較［J］．食品研究與開發，2006，27(3):116－118．

［10］姜心，陳偉，周波，等．纖維素酶活測定影響因素的研究［J］．食品工業科技，2010，31(5):265－268．

［11］管斌，謝來蘇，丁方，等．纖維素酶酶活力測定方法的校正［J］．無錫輕工大學學報，1999，18(4):20－26．

［12］夏服寶，邱雁臨，孫憲迅．纖維素酶活力測定條件研究［J］．飼料工業，2005，26(16):23－25．

［13］張全國，張志萍，趙民善，等．秸稈制氫過程中纖維素酶酶活測定方法研究［J］．熱科學與技術，2011，10(2):128－132．

［14］焦巧芳．中藥渣微生物轉化利用菌種篩選研究［D］．杭州:浙江師范大學，2010．

［15］朱新術，楊志強，李建喜，等．發酵黃芪的乳酸菌的馴化及其與黃芪相互作用研究［J］．中國微生態學雜志，2008，20(5): 450－455．

［16］李紅亞，李術娜，王樹香，等．解淀粉芽孢桿菌MN－8對玉米秸稈木質纖維素的降解［J］．應用生態學報，2015，26(5): 1404－1410．

［17］崔海洋，程仕偉，黃田紅，等．產纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌分離鑒定及酶學性質研究［J］．食品科學技術學報，2014，32 (3):43－47．

［18］王凱，藍江林，劉波，等．解淀粉芽胞桿菌FJAT－8754產纖維素酶和淀粉酶特性及發酵條件優化［J］．福建農業學報，2014，29(4):357－363．

Study on Screening and Identification of a strain for fermentation of Radix Astragalus and its Enzymic Characters

WANG Yan，LIU Yu，HOU Mei-ru，YIN Jun-yi，ZHU Qing-he，QIN Ping-wei，SHI Tong-rui
(Heilongjiang Institute of Veterinary Medicine Science，Qiqihaer 161006，China)

In order to isolate the strains which have fermenting performance for Radix Astragalus，the Radix Astragali samples were inoculated on nutrient agar medium and cultivation at 30℃，and then the isolating strains were inoculated on the cellulose-congo red agar，Screening the bacteria which can form a larger cellulose-decomposing zone to identification based on molecular biological method was performed，and the activity of the cellulose was determined．The results showed that the isolated strain was identified as Bacillus amyloliq-uefaciens，and the ratio of H/C was 4.03．The highest cellulase activity reached 32.16 U/mL when cultivated at 37℃for 36 h．The cellulase activity was stable at temperatures lower than 60℃and at pH range of 6.0－8．0，which retained more than 90%．

Radix Astragalus;Fermentation of Chinese herbal medicine;Cellulase;Bacillus amyloliquefaciens

SHI Tong-rui

A

0529-6005(2017)01-0100-03

2015-07-21

黑龍江科技計劃項目(GC13B404)

王巖(1976－)，女，高級獸醫師，本科，從事微生態制劑研發工作，E-mail:wangyan200705@sina．com

史同瑞，E-mail:systr@sina．com