檸檬烯抗菌性研究進展

郝靜梅，盛冉，孫志高*，黃巧娟，于奉生，方明

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712) 2(廣東省食品藥品職業技術學校，廣東 廣州，510663)

檸檬烯抗菌性研究進展

郝靜梅1，盛冉1，孫志高1*，黃巧娟2，于奉生1，方明1

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712) 2(廣東省食品藥品職業技術學校，廣東 廣州，510663)

檸檬烯(limonene)是廣泛存在于植物中的一種天然單萜烯，是自然界除蒎烯外分布最廣的萜烯，具有抗菌、消炎和抗腫瘤等多種生物功能。當前食品衛生和醫藥安全等問題越來越引起公眾的重視，研究天然的抗菌保鮮劑已成為研究的熱點。此文綜述了近年來檸檬烯對微生物的抑制作用、作用機理、應用及發展趨勢，以期為安全、高效的天然食品防腐保鮮劑的開發及應用提供參考。

檸檬烯；抗菌；作用機制；應用

檸檬烯又稱苧烯，學名1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環己烯，是一種重要的單環單萜烯，廣泛存在于柑橘、蔬菜等植物中，尤其在柑橘類水果的精油中含量較多，如在甜橙果皮精油中其含量高達90%～95%[1-3]。天然檸檬烯以3種異構體的形式存在于植物精油中，即D-檸檬烯、L-檸檬烯和DL-檸檬烯，其中D-檸檬烯最為常見。由于檸檬烯具有抗菌、抗氧化、抗癌、止咳平喘和抗炎等生理功能，已被廣泛應用于食品、香料、醫藥和化工等領域[4]。

隨著人們安全意識的日益增加，食品安全問題是食品行業最關心的問題，研究證實真菌和細菌是引起食品腐敗變質的重要因素[5]?；瘜W類食品防腐劑如山梨酸、苯甲酸、丙酸及其鹽類等因抑菌性強、使用成本低等特點，在食品行業應用廣泛，但由于這些防腐劑溶解性低、安全性差及致癌性等問題，也越來越顯示出局限性[6]。近年的相關研究表明，植物類的天然抗菌性成分可替代化學防腐劑來防止食品的腐敗變質，如中國國家標準(GB2760—2011 食品添加劑使用標準)規定D-檸檬烯即為允許使用的香料[7]，同時檸檬烯也因來源廣泛、安全性好和抗菌性強等優點，成為當下研究熱點。

1 檸檬烯的抗菌特性

檸檬烯具有廣譜抗菌性，可顯著抑制革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌及真菌的活性[8]。檸檬烯的抗菌強度與檸檬烯的濃度、菌株種類、作用形式、pH值、溫度、作用時間和試驗方法等多因素有關，同時檸檬烯的易揮發性、疏水性及是否添加表面活性劑等均會導致抑菌結果的差異性[8]。

1.1 檸檬烯抑制細菌

食品在加工及貯藏過程中容易受到金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌和枯草芽孢桿菌等細菌的污染，近年來通過國內外學者對檸檬烯的抗菌性研究證實，檸檬烯對這些細菌均有較好的抑制作用，詳見表1。

1970年，DABBAH等[9]研究了橙、檸檬及葡萄柚的除萜精油、D-檸檬烯、香葉醇等在體外對山夫登堡沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和假單胞菌屬的抑制作用，結果表明D-檸檬烯對這4種菌的抑制率為86%～100%，同時發現已放置4年的D-檸檬烯比新產檸檬烯對山夫登堡沙門氏菌的抑制性更強，抑制率高達100%，這是因為檸檬烯氧化生成了檸檬烯氧化物，它對山夫登堡沙門氏菌具有更強抑制作用。2008年，O′Bryan CA[12]等研究證實D-檸檬烯對試驗用11種沙門氏菌均有抑制作用，其最小抑菌體積分數為1%。LIS-BALCHIN等[15]研究了檸檬烯的2種對映體在體外對20種單細胞增生李斯特菌的抗菌性，結果表明(+)-檸檬烯具有更強的抑菌活性，這兩種檸檬烯對映體的抗菌性強弱差異是因所作用的菌種不同所致。

表1 檸檬烯對細菌的抑制作用

1.2 檸檬烯抑制真菌

近年來研究表明檸檬烯和含有檸檬烯的精油均具有抗菌性，且能抑制多種真菌(如表2所示)，但研究表明D-檸檬烯對真菌的抑制作用比精油更強。2011年，MAHDAVI等[11]采用瓊脂擴散法和紙片擴散法研究了檸檬烯和果皮提取物對黑曲霉菌、黃曲霉菌及青霉菌等的抑制作用，結果表明左旋檸檬烯比右旋檸檬烯的抑菌性強，檸檬烯對受試菌均有顯著的抑制作用，尤其對黑曲霉菌的抑制作用更為明顯，而柑橘香精油對受試菌沒有表現出明顯的抑菌性。2012年李巧巧等[12]研究了D-檸檬烯及柑橘精油對酵母、毛霉和青霉等的抑菌性，將浸透精油或檸檬烯的濾紙片放置于已干燥的培養基表面，在合適的條件下培養，結果表明抑菌由強到弱依次為D-檸檬烯、檸檬油、柚油、橙油；將浸透精油或檸檬烯的濾紙片放在培養皿的皿蓋中心，并倒置培養后發現，只有D-檸檬烯能對酵母、青霉形成抑菌圈。SINGH等[16]研究了柑橘香精油及其主要成分檸檬烯的抗菌活性，發現檸檬烯對黃曲霉的抑制性比香精油更強，即使在很低濃度下仍然具有很好的抑制效果，詳見表2所示。

表2 檸檬烯及含檸檬烯的香精油對真菌的抑制作用

2 檸檬烯抗菌機理

近年來，大量文獻證實檸檬烯具有廣譜的抗菌性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黃曲霉等細菌和真菌均具有抑制作用[1-26]。然而到目前為止檸檬烯的抗菌機理尚未獲得明確結論，但研究者普遍認可，通過破壞菌體細胞膜的完整性，從而抑制微生物生長是檸檬烯的主要抗菌機制。綜合文獻報道檸檬烯的抗菌機理主要為以下幾方面。

2.1 破壞微生物的生物膜

檸檬烯作用于菌體的細胞壁或生物膜系統，進而破壞其完整性，改變細胞膜的滲透性，使內容物外泄，降低其生物活性，從而導致細胞不能正常生長繁殖，甚至死亡。

1989年KNOBLOCH等研究證實精油中的生物活性成分可滲透細胞的細胞壁，溶解細胞膜磷脂的雙分子層發揮其抗菌性[26]。2006年 ROSANGELA等[27-28]研究了檸檬烯、肉桂醛、丁香酚和香芹酚等物質在亞致死濃度條件下對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、熒光假單胞菌和嗜熱甲烷八聯球菌細胞膜的影響，經過掃描電鏡觀察到，檸檬烯等物質作用于受試菌后，能引起細胞膜結構的明顯變化；通過氣相色譜分析發現，受試菌的細胞膜中其不飽和脂肪酸的含量明顯減少，其中C18∶2反式脂肪酸和C18∶3的順式脂肪酸大幅度減少，也直接導致細胞膜總脂肪酸含量的減少，進而發揮出檸檬烯的抗菌作用。2014年TAO等研究了檸檬烯、檸檬醛等單萜類化合物對青霉和綠霉的抑制作用，通過電鏡掃描發現，處理組的霉菌形狀發生了明顯的扭曲和體積變小，且細胞外電導率和pH值也發生了變化，這表明檸檬烯破壞了霉菌的細胞膜，導致細胞內容物泄漏，降低了其生物活性、進而阻礙了霉菌細胞的生長[29]。胡菲菲[30]通過對釀酒酵母耐受D-檸檬烯脅迫的蛋白組分的分析，認為D-檸檬烯破壞了釀酒酵母的細胞膜結構，導致細胞膜脂筏受損，直接破壞了釀酒細胞膜的信號傳遞和物質轉運功能。ESPINA等[31-35]研究了D-檸檬烯對大腸桿菌、單細胞增生李斯特菌等的抑菌作用與機制，發現在pH值為4.0時D-檸檬烯可破壞微生物的細胞膜，暴露出細胞質及細胞質膜增加了細胞膜通透性，導致因內容物泄漏而破壞細胞正常的生理功能，從而現實抑菌。

2.2 影響微生物的能量代謝

生命活動都是耗能反應，能量代謝是維持細胞正常生命活動的基礎，能量代謝異?；蛑袛嗫梢鹕顒拥耐Ｖ?。檸檬烯可通過干擾菌體內正常的酶促反應和能量代謝，從而打破微生物的代謝平衡。KNOBLOCH等[26]研究了萜類物質對微生物的初生能量代謝、NADH活性以及呼吸過程中電子傳遞過程等作用，結果表明檸檬烯濃度在5×10-3mol/L時就可起到抑制作用，干擾細胞內能量代謝的酶促反應，并通過溶解油脂影響生物膜的催化反應，如呼吸代謝途徑等。胡菲菲[30]在研究釀酒酵母耐受D-檸檬烯脅迫的蛋白組學分析時發現，在D-檸檬烯的脅迫下釀酒酵母對能量的需求增加，出現葡萄糖饑渴的假象。

2.3 破壞微生物DNA的結構或改變其功能

DNA作為生物遺傳信息的載體，在細胞物質合成和遺傳代謝過程中起到十分重要的作用。DNA的微小損傷都會影響微生物的正常代謝和繁殖。檸檬烯能破壞DNA結構、抑制基因的正常表達，進而影響微生物正常的生長代謝。胡菲菲[30]研究發現，D-檸檬烯能脅迫下調釀酒酵母細胞中具有DNA修復功能的Rp4p和調控細胞增殖分裂功能的Cprlp，從而抑制細胞增殖。

2.4 抑制微生物體內的酶或功能蛋白

MAREI等[36]研究了包括檸檬烯在內的12種物質抗真菌活性，以及檸檬烯對受試菌的果膠甲酯酶、纖維素酶和多酚氧化酶的抑制作用。其結果表明，檸檬烯對果膠甲酯酶和纖維素酶有強烈的抑制作用，而對多酚氧化酶沒有抑制作用，認為檸檬烯等單萜類物質抑制了纖維素酶和果膠甲酯酶的活性，延緩或終止了微生物的化學反應，進而產生抗菌作用。

3 檸檬烯抗菌性的應用

檸檬烯具有資源豐富、來源廣泛、天然安全等優勢，已在食品、果蔬的防腐保鮮等領域得到了很好應用。李巧巧等[12]對D-檸檬烯的抗菌性在面包上的應用進行了初步研究，結果證實D-檸檬烯在氣體狀態下能有效抑制那些能導致面包腐敗的酵母和青霉菌，能對面包起到較好的防腐保鮮作用。高紅亮等[37]研究了檸檬烯乳化及其在橙汁中的保鮮效果，發現濃度不低于0.5 g/L的檸檬烯乳化液就能對橙汁起到顯著的保鮮效果，其細菌總數、pH值變化及感官品質等指標均明顯優于對照組。

4 結論與展望

綜上所述，從柑橘皮渣中提取的檸檬烯具有廣譜的抑菌性，能有效抑制微生物的生長及預防食品腐敗變質，可部分替代化學抗菌劑。但檸檬烯作為新型抑菌劑還有待進一步研究。一方面，關于檸檬烯的抑菌性研究大多數都集中在離體試驗，而活體試驗很少，研究結果的科學性、廣譜性等也受此局限，不利于檸檬烯的進一步廣泛應用；另一方面，目前檸檬烯的抑菌性研究還處于初步階段，對檸檬烯的抑菌機理研究尚不十分準確。此外，檸檬烯的應用技術研究及相關產品的開發也很少。因此，作者認為，今后應系統、深入研究檸檬烯在活體中的抑菌效果、進一步明確檸檬烯的抑菌機理，同時加大開發適應市場發展方向和需求的檸檬烯相關新產品。

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Research progress in antimicrobial activity of limonene

HAO Jing-mei1, SHENG Ran1, SUN Zhi-gao1*, HUANG Qiao-juan2,YU Feng-sheng1, FANG Ming1

1(Southwest University,Citrus Research Institute, Chongqing 400712,China)2(Guangdong Food and Drug Vocational-technical School,Guangzhou 510663,China)

Limonene is one of the most widely distributed terpenes in nature except pinene, and it has many bioactivities such as antibacterial activity, anti-inflammatory activity, and anti-tumor activity. Currently,food hygiene and medical safety have attracted more and more public attention. Studies on natural biopreservatives have become the focus of multidisciplinary research. The antifungal activity of limonene, its action mechanism, its application and development trend were reviewed in this paper to provide a theoretical reference for the development and application of natural food preservatives.

limonene; antibacterial; mechanism of action; application

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702046

碩士研究生(孫志高副研究員為通訊作者，E-mail: cpro@cric.cn)。

四川省科技支撐計劃項目(項目編號：2014NZ0062)

2016-08-18，改回日期：2016-10-31