鵝Caspase-1基因的克隆與序列分析

劉文俊，邱金輝，陽佑天，黃運茂，許丹寧，田允波

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510225；3.佛山科學技術學院醫(yī)藥工程學院，廣東 佛山 528000）

廣東是養(yǎng)鵝大省，素有“水禽之鄉(xiāng)”的美譽，2009年以來鵝飼養(yǎng)量穩(wěn)定在7 000萬只以上，每年以2%左右的速度遞增［1-2］。養(yǎng)殖技術水平落后引致的免疫紊亂、疫病頻發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟損失，限制了養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展［3］。炎癥在動物疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，對炎癥系統(tǒng)的研究有助于從分子層面了解致病機制。

半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是一類具有特異性天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，該家族蛋白在細胞凋亡和炎癥機制網(wǎng)絡中居中心地位［4］。Caspase-1是Caspase家族中最早被鑒定的成員，其在細胞凋亡中的作用并不突出，但是在炎癥的發(fā)生中起關鍵作用［5］。該蛋白以前體pro-Caspase-1的形式存在于細胞質(zhì)中，被稱為“炎性體”的胞質(zhì)中多種蛋白構(gòu)成的復合體激活，水解成具有活性的Caspase-1，并進一步切割/加工前白介素1β（pro-IL-1β）和前白介素18（pro-IL-18），使之成為成熟的促炎細胞因子IL-1β和IL-18，進而促使細胞炎癥的發(fā)生［6-7］。NLRP3炎性體是研究最為透徹的炎性體之一，該炎性體于2002年由Martinon等研究發(fā)現(xiàn)，它由NLRP3分子與下游凋亡相關點樣蛋白（ASC）、Caspase-1組成，該復合體對Caspase-1的激活非常重要［8-9］。NLRP3蛋白主要表達于巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞等髓系細胞，能夠被多種類型的刺激物激活，包括損傷/危險信號相關分子模式（DAMP）和病原體相關分子模式（PAMP），可通過識別胞內(nèi)的ROS等因子激活，激活的Caspase-1還可降解抗炎因子Sirtuin-1〔一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴的組蛋白脫乙酰酶蛋白〕，在細胞內(nèi)誘導其他炎癥途徑的激活［10］。

目前關于鵝炎癥系統(tǒng)的基礎研究未見報道，相關基因還未有克隆。本研究采用兼并引物法，參考雞的Caspase-1基因設計引物，克隆鵝炎癥通路關鍵蛋白Caspase-1全長基因，并進行了系統(tǒng)的生物信息學分析，為進一步研究鵝炎癥系統(tǒng)的功能和作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物：70日齡健康馬崗鵝3只，購自清遠市金羽豐鵝業(yè)有限公司。屠宰后，無菌采集鵝的脾臟，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：Trizol RNA 提取試劑盒、PrimeScript RT-Master反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒、pMD18-T Vector、Marker、DH5α感受態(tài)細胞等，均購自TaKaRa公司。

主要儀器：核酸凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 4100，上海）、超微量分光光度計（Nano-200，美國）、PCR儀（ABI2720，美國）和4℃冷凍高速離心機（Thermo，美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計及合成 參照GenBank數(shù)據(jù)庫中雞Caspase-1基因的核苷酸序列（No.AF031351），設計1對PCR擴增引物對（P1：5′CAGGGCCACCCCGCAGAC3′，P2：5′GGGTGGAAGTGGCTCTCAGGG3′），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 RNA提取與全長基因擴增 采用Trizol RNA提取試劑盒，從鵝脾臟中提取總RNA，cDNA的合成采用PrimeScript RT-Master反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明書操作。以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用引物對Caspase-1基因進行PCR擴增，總反應體系為25μL，包括 10×PCR buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，上下游引物（10μmol/L）各 0.75μL，Ex Taq 0.25 μL，dH2O 16.75μL，cDNA模板 2μL。反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 2 min，30個循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測。在紫外燈下切取目的片段，利用凝膠回收試劑盒按說明回收純化，并連接T載體，使用BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定后，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.3 序列分析與結(jié)構(gòu)預測 測序結(jié)果采用Seqmen軟件進行拼接，使用Blast N程序?qū)⑵唇有蛄性贕enBank數(shù)據(jù)庫中比對鑒定。ORF分析采用SeqBuilder軟件進行劃分，并翻譯成氨基酸序列。在GenBank數(shù)據(jù)庫下載已發(fā)表的所有物種Caspase-1基因序列，用MegAlign軟件進行同源性比較。蛋白理化性質(zhì)分析采用ExPAsy服務系統(tǒng)中的ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）；蛋白二級結(jié)構(gòu)分析采用PredictProtein 在線分析工具（https：//www.predictprotein.org/）；蛋白結(jié)構(gòu)域分析采用NCBI CDD Tools在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；蛋白三維建模，通過將氨基酸序列提交至瑞士生物信息研究所（SIB）SWISS-MODEL服務器（http：//swissmodel.expasy.org/），利用 Automated Mode，搜索與目的序列結(jié)構(gòu)相似的氨基酸序列，以搜索到的模板蛋白質(zhì)PDB作為同源性模板預測蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)［11］。利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，基于General Time Reversible model（GTR） 模型，以最大似然法構(gòu)建進化樹，并采用重復抽樣分析1 000次的方法檢驗各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬崗鵝Caspase-1基因克隆和序列測定

應用兼并引物，以鵝脾臟cDNA為模板，RT-PCR擴增，凝膠電泳結(jié)果顯示成功擴增片段，長度約為1 200 bp（圖1）。對目的片段連接的T載體進行酶切和測序驗證，測序結(jié)果顯示大小為1 233 bp（圖2）。通過GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast N比對，鑒定結(jié)果顯示所克隆的基因為Caspase-1基因，表明成功克隆了鵝Caspase-1基因，命名為go-Caspase-1。SeqBuilder軟件ORF Finder分析顯示，go-Caspase-1擴增片段包含完整的ORF，長度為813 bp，編碼270個氨基酸（圖3）。將該序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為MG463109。

圖1 馬崗鵝Caspase-1基因的擴增

圖2 馬崗鵝Caspase-1質(zhì)粒的酶切鑒定

圖3 馬崗鵝Caspase-1核苷酸及蛋白質(zhì)序列

2.2 Caspase-1基因序列同源性分析

使用DNAstar軟件將鵝與人、鼠、大鼠、豬、牛、羊、馬、雞、鴨、家蠅等18個物種的Caspase-1編碼區(qū)進行基因同源性比對分析，結(jié)果（圖4）顯示，鵝與其他物種的同源性在99.1%～37.4%之間，鵝與鴨的同源性最高為99.1%，與雞達到84.6%，與中華鱉為64.7%，與余物種的基因同源性均低于60%，證明不同物種間該基因的同源性差異較大，在禽類中有較高的同源性。

圖4 不同物種Caspase-1基因的核苷酸同源性（%）比較

2.3 go-Caspase-1蛋白基本理化特征分析

采用DNAstar軟件和ExPAsy服務系統(tǒng)中的ProtParam工具對Caspase-1基因編碼蛋白序列的基本理化性質(zhì)進行綜合預測分析。結(jié)果表明，go-Caspase-1蛋白共含有270個氨基酸，分子式為C1383H2166N388O405S13，分子量31.13 ku；含帶正電的氨基酸（Arg+Lys）33個、帶負電的氨基酸（Asp+Glu）32個，理論等電點為7.8；含疏水氨基酸86個、極性氨基酸73個，總平均疏水性（GRAVY）為-0.42，說明該蛋白質(zhì)具有親水性，蛋白在體內(nèi)的半衰期為30 h，屬于長壽命蛋白。使用PredicrProtein在線分析工具對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明該蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Loop）占61.48%，α螺旋結(jié)構(gòu)（alphahelix）占21.85%，β折疊結(jié)構(gòu)（beta-sheet）占16.67%；go-Caspase-1蛋白由20種氨基酸組成，各氨基酸含量在1.1%～10%之間，其中亮氨酸含量最高（占10%）、丙氨酸占4.1%、谷氨酸占3.7%、甲硫氨酸占3.7%，與該蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)的形成有關。對α螺旋結(jié)構(gòu)阻礙性較強的脯氨酸（4.8%）和甘氨酸（4.8%）含量較高，可能是蛋白結(jié)構(gòu)以環(huán)狀結(jié)構(gòu)為主的原因。

2.4 go-Caspase-1蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

采用NCBI CDD Tools在線軟件分析Caspase-1分子的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示go-Caspase-1分子主體包含半胱氨酸蛋白酶（CASc Superfamily，CAScS ）結(jié)構(gòu)域，符合典型的Caspase-1結(jié)構(gòu)特征。比較不同物種Caspase-1蛋白，結(jié)果（圖5）顯示，鵝含有270個氨基酸，鴨含有217個氨基酸，雞含有283個氨基酸，與人（404個氨基酸）、鼠（402個氨基酸）等哺乳類動物蛋白大小相差較大。結(jié)構(gòu)上所有物種均含有CAScS結(jié)構(gòu)域，且結(jié)構(gòu)域內(nèi)的功能結(jié)構(gòu)基本相同，推測各物種該蛋白均具有相同的功能。此外，分析結(jié)果顯示禽類Caspase-1蛋白均不含有死亡結(jié)構(gòu)域（Death domain superfamily，DDS）。

2.5 Caspase-1蛋白三維結(jié)構(gòu)分析

采用SWISS-MODEL （ ProMod version1.1.0）3D同源建模對Caspase-1蛋白進行三維結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果如圖6所示。同源搜索結(jié)果顯示最相似的蛋白模型PBD號為3e4c.1.A，go- Caspase-1蛋白3D預測結(jié)果顯示模型覆蓋率為97%，全模型質(zhì)量估測（Global Model Quality Estimation，GMQE）值為0.74，該數(shù)值越接近1則建模質(zhì)量越高；全模型和每個殘基模型質(zhì)量（Global and per-residue model quality，QMEAN）值為 -2.66，該數(shù)值大于-4，表明建模質(zhì)量優(yōu)秀，評分結(jié)果表明預測模型可信。建模結(jié)果顯示，鵝與雞和人的Caspase-1蛋白三維結(jié)構(gòu)呈大致相同的空間構(gòu)型，由α螺旋結(jié)構(gòu)和β折疊結(jié)構(gòu)或環(huán)裝結(jié)構(gòu)交替組成。僅有幾處細微結(jié)構(gòu)上的差別（圖6箭頭所示），N端的差異最為顯著，人Caspase-1蛋白有一段較長的α螺旋結(jié)構(gòu)，鵝與雞在N端的螺旋結(jié)構(gòu)較短；此外，3種蛋白還存在部分環(huán)狀結(jié)構(gòu)的空間差異，但對于整體空間結(jié)構(gòu)影響較小，研究結(jié)果驗證了Caspase-1蛋白的空間結(jié)構(gòu)的保守性。

圖5 不同物種Caspase-1蛋白結(jié)構(gòu)域比較

圖6 不同物種Caspase-1蛋白三維結(jié)構(gòu)比較

2.6 Caspase-1基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

不同物種間Caspase-1基因分子進化分析結(jié)果顯示，Caspase-1基因的物種進化呈較明顯的分化（圖7），家蠅等屬于節(jié)肢動物門，其進化程度相對較低，進化地位最原始，成為一個分支，位于整個進化樹的基部；其他物種均屬于脊索動物門中的脊椎動物亞門，共同組成一個大分支。其中硬骨魚綱鰈形目牙鲆，進化地位較低，單獨一支位于底部；脊椎動物亞門中的哺乳綱、鳥綱、爬行綱組成一個較大的分支。鵝與同屬水禽的鴨基因進化距離最近，與雞同屬一個分支，爬行綱的中華鱉其基因與禽類的進化距離較近。

圖7 Caspase-1基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 結(jié)論與討論

廣東養(yǎng)鵝業(yè)具有得天獨厚的自然環(huán)境和種質(zhì)資源，廣東四大名鵝（馬崗鵝、陽江鵝、獅頭鵝、烏鬃鵝）中包含世界上最大的鵝種獅頭鵝和最小的鵝種烏鬃鵝，本研究的樣品采自廣東養(yǎng)殖規(guī)模最大的馬崗鵝。伴隨著鵝養(yǎng)殖量逐年增加，相應的問題也愈發(fā)突出，粗放的養(yǎng)殖模式導致的疫病高發(fā)與生長緩慢，限制了行業(yè)的發(fā)展。炎癥是疫病發(fā)生發(fā)展的核心，適度的炎癥反應有助于機體對抗損傷，但如果炎癥細胞過度活化，則會加重損傷，所帶來的細胞病變及生理功能障礙是造成疾病的主要因素［12］。

Caspase 家族的共同特征是能通過自身催化位點的半胱氨酸殘基特異性切割目標蛋白的天冬氨酸殘基，在調(diào)控炎癥反應和細胞凋亡中起重要作用。其中Caspase-1、Caspase-4和Caspase-5參與炎癥反應的誘導，Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10參與細胞凋亡的誘導過程，而Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7是細胞凋亡發(fā)生的效應蛋白。該家族蛋白比較保守，染色體所處的位置也較為相似。人Caspase-1蛋白可以分成3個結(jié)構(gòu)域：N端主要包含一個CARD區(qū)，該區(qū)能夠與其他攜帶CARD區(qū)的蛋白相互結(jié)合；p20大亞基與p10小亞基則是發(fā)揮Caspase-1催化活性的區(qū)域，激活后p20與p10形成二聚體，再進一步形成四聚體，發(fā)揮其生物學功能［13］。Caspase-1蛋白可以被多種炎性體激活，如NLRP1炎性體、NLRP3炎性體、AIM2炎性體、RIG-I炎性體以及NLRC4炎性體等［14-15］。其在體內(nèi)扮演了調(diào)控細胞程序性死亡、調(diào)控炎癥反應、介導炎癥性壞死等多種角色，對Caspase-1的進一步研究有助于了解炎癥系統(tǒng)，從而達到預防和治療疾病的目的［16］。

本研究首次克隆了馬崗鵝Caspase-1基因，并對其基因同源性、進化表達蛋白的特性、結(jié)構(gòu)域及空間結(jié)構(gòu)進行了分析，結(jié)果顯示，家禽的Caspase-1基因同源性較高，但與哺乳類動物在基因長度和蛋白結(jié)構(gòu)域上存在較大差異，禽類Caspase-1基因均不含有DDS 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過與DDS家族其他成員包括PYRIN和DED（Death Effector Domain）相關聯(lián)，是信號通路中的銜接子，該部分結(jié)構(gòu)的差異預示禽類在Caspase-1激活的機制上可能與哺乳類動物存在差異。Caspase-1基因在細胞生長、死亡、炎性等多種過程中發(fā)揮重要作用，圍繞該基因進一步研究，將有助于疫病的防控和揭示家禽免疫系統(tǒng)的調(diào)控機制。

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