五味子色素的提取工藝優化及其穩定性研究

王珊珊，谷 舞，許 汝，李泰雅，王繽晨

（1．沈陽工學院生命工程學院，遼寧撫順 113122；2．大連工業大學食品學院，遼寧大連 116034）

五味子色素的提取工藝優化及其穩定性研究

王珊珊1，谷 舞1，許 汝1，李泰雅1，王繽晨2

（1．沈陽工學院生命工程學院，遼寧撫順 113122；2．大連工業大學食品學院，遼寧大連 116034）

以五味子色素提取液中花色素苷含量為指標，乙醇濃度、提取時間、料液比、提取溫度為考察因素，在單因素實驗基礎上利用響應面方法優化五味子色素提取工藝，并以色素色度為指標，研究五味子色素的穩定性。結果表明，以55%濃度乙醇為提取液，按1∶20 g／mL的料液比，在80℃下提取80 min，五味子色素提取量最大，為11．89 mg／L。五味子色素穩定性實驗表明：五味子色素光穩定性較好；蔗糖、抗壞血酸對色素有穩定、增色作用；五味子色素易被雙氧水氧化；在酸性、中性和弱堿性條件下五味子色素較穩定，強堿條件下顏色改變；Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋對色素穩定性無明顯影響，Al3＋對色素穩定性有破壞作用，Fe3＋、Cu2＋對色素穩定性有保護作用。

五味子色素；提取；響應面分析；穩定性

五味子（Schisandra chiennsis Bail）為我國常用滋補強壯中藥，始載于神農本草經，結合代表五行的辛、甘、酸、苦、咸五種味道于一身［1］。五味子具有多種有效成分和多項藥理作用［2］，能調節心腦血管系統、改善血液循環、興奮中樞神經，對治療疲勞、嗜睡、神經衰弱有特效。適量的五味子還有利于恢復心肌的正常功能［3］。天然植物色素多具有很強的藥理作用，具有明顯的抗氧化［4－5］、抗癌活性［6－8］作用，加上其安全性高、色澤鮮艷，常被用來做食品著色劑［9］，五味子中含有豐富的花色素苷類天然紅色素，具有抗氧化［10］、抗突變［11］和預防心血管疾病［12］等生理學功能，是一種極具開發潛力的天然活性成分，可廣泛應用于食品、藥品、化妝品等產業［13］。目前已知的花色素苷類色素有20多種，常見的有矢車菊素、天竺葵素、飛燕草素、芍藥素、牽牛素、錦葵素。近年來，國內外對植物源天然色素的研究較為關注，但有關五味子色素的報道不多。因此，對五味子色素提取工藝及穩定性進行研究具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

五味子：撫順市成大方圓連鎖大藥房。

乙醇、過氧化氫、抗壞血酸、蔗糖、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鋁、氯化鉀、碳酸鈉、硫酸鎂、氯化鐵、氯化鈣：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

恒溫水浴鍋HH－6：常州國華電器有限公司；電子天平JD100－3：沈陽龍騰電子有限公司；低速臺式離心機TDL－40B：上海安亭科學儀器廠；pH計PHS－3CU、可見分光光度計721、恒溫培養箱HPX－9052MBE、高壓立式蒸汽滅菌鍋YXQ－LS－50SⅡ、垂直流超凈工作臺SW－CJ－2FD、大容量恒溫搖床KYC1112：上海精密科學儀器有限公司。

1．2 五味子色素提取條件的優化

以提取液中花色素苷的含量為指標，料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間為考察因素，在單因素實驗基礎上通過響應面法優化五味子色素的提取。

1．3 色素的穩定性研究

色素色度測定：以在最佳提取工藝下制備的色素提取液為處理對象，在五味子色素的三個顯著波長（506、519、532 nm）［14－17］下測得吸光度，取平均值。

1．3．1 光照對色素穩定性的影響

取100 mL色素原液（在最佳工藝下制備的色素提取液），于不同環境（室內散光、紫外燈、日光燈）下靜置，1、2、3、4、5 h時分別測色素液的色度。

1．3．2 蔗糖對色素穩定性的影響

取5份100 mL的色素原液，加入蔗糖，使其濃度為0、2%、4%、6%、8%。在室溫下放置0．5、1、1．5、2、2．5 h，分別測色素提取液的色度。

1．3．3 過氧化氫對色素穩定性的影響

取4份100 mL的色素原液，加入過氧化氫，使其濃度為0．5%、1%、1．5%、2%。在室溫下放置1、 2、3、4、5 h，分別測色素提取液的色度。

1．3．4 抗壞血酸對色素穩定性的影響

取5份100 mL的色素原液，加入抗壞血酸，使其濃度分別為0、1%，、2%、3%、4%。在室溫下放置0．5、1、1．5、2、2．5 h，分別測色素提取液的色度。

1．3．5 pH值對色素穩定性的影響

取色素原液，使用一定濃度的鹽酸和氫氧化鈉溶液，將色素液調節到不同pH值，觀察其顏色變化。

1．3．6 金屬離子對色素穩定性的影響

取6份100 mL的色素原液，分別配制含有0．02 mol／L的Fe3＋、Cu2＋、Mg2＋、Al3＋、Na＋、K＋的色素溶液，放置10、20、30、40、50 min后，測色素提取液的色度［14］。

2 結果與分析

2．1 五味子色素中花色素苷含量的測定

由于五味子色素目前無標準品作為含量檢測對照，本實驗以五味子色素提取液中花色素苷的含量來鑒定五味子色素的提取效果，采用Giusti等報道的pH示差法測定樣品中花色素苷的含量［18－20］，根據文獻［21－22］報道，在不清楚待測樣品主要成分時以矢車菊色素－3－葡萄糖苷作為對照標準樣品，計算公式為：

花色素苷含量／（mg／L）＝［（Aλvis－max－A700）× pH1．0－（Aλvis－max－A700）×pH4．5］×MW×DF× 1 000／ε×1

式中：Aλvis－max—樣品提取液在可見光區的最高吸收波長（λvis－max）的吸光值；A700—700 nm處的吸光值；MW—矢車菊色素－3－葡萄糖苷標準分子質量，449．2 g／mol；ε—矢車菊色素－3－葡萄糖苷消光系數，26 900 L／mol／cm；DF—樣品稀釋后的體積／最初的體積。

2．2 五味子色素提取單因素實驗結果

2．2．1 料液比對色素提取的影響

準確稱取5份5 g的五味子粉末，分別置于250 mL三角瓶中，配置濃度為55%的乙醇，分別按料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g／mL的體積加入三角瓶中，在70℃下水浴1 h，離心去沉淀取上清液，測定花色素苷含量。

由圖1可看出，當乙醇濃度為55%，70℃水浴1 h，不同料液比條件下色素含量先迅速增高后以一定速率逐漸降低，料液比為1∶20時含量最高，為9．852 mg／L，當料液比小于1∶20時含量幾乎呈直線下降。

2．2．2 乙醇濃度對色素提取的影響

準確稱取5份5 g五味子粉末，分別置于250 mL三角瓶中，分別加入濃度為45%、55%、65%、75%、85%的乙醇100 mL，在70℃水浴鍋中水浴1 h，4 000 r／min離心15 min去沉淀取上清液，測定花色素苷含量。

由圖2可看出，料液比為1∶20 g／mL在70℃條件下浸提1 h，當乙醇濃度從45%提高至55%時花色素苷含量略有上升，當乙醇濃度為55%時出現峰值，含量為8．447 mg／L，當乙醇濃度大于55%時，隨著乙醇濃度的提高花色素苷含量逐漸降低。

圖1 料液比對色素提取的影響

圖2 乙醇濃度對色素提取的影響

2．2．3 提取溫度對色素提取的影響

準確稱取5份5 g五味子粉末，分別置于250 mL三角瓶中，按料液比為1∶20 g／mL加入55%的乙醇，分別置于溫度為40、50、60、70、80℃的水浴鍋中水浴1 h，離心去沉淀取上清液，測定花色素苷含量。

由圖3可看出，當乙醇濃度為55%，料液比1∶20 g／mL，在不同溫度下水浴1 h，隨著溫度的提高，花色素苷含量先呈梯度上升，后迅速降低。在40～50℃之間含量基本沒變化，高于50℃后隨著溫度的提高，花色素苷含量緩慢上升，70℃時達到峰值，為最適提取溫度，在該溫度下的含量為10．504 mg／L，再提高溫度，花色素苷含量迅速下降。

2．2．4 提取時間對色素提取的影響

準確稱取5份5 g五味子粉末，分別置于250 mL三角瓶中，按料液比1∶20 g／mL加入55%的乙醇，在70℃水浴鍋中分別水浴40、50、60、70、80 min，離心去沉淀取上清液，測定花色素苷含量。

由圖4可看出，乙醇濃度為55%，料液比1∶20 g／mL，在70℃條件下水浴，隨著水浴時間的延長，花色素苷含量先提高后降低。在時間為40～50 min間花色素苷含量幾乎不變，大于60 min后再延長水浴時間，花色素苷含量迅速提高，在70 min時含量最大，為11．347 mg／L，超過70 min后含量迅速降低。

圖3 提取溫度對色素提取的影響

圖4 提取時間對色素提取的影響

2．3 響應面分析法優化五味子色素提取工藝

2．3．1 回歸模型的建立及方差分析

在單因素實驗基礎上利用Design－Expert軟件進行Box－Behnken設計和數據處理，確定最佳提取工藝。

根據單因素實驗結果，選取花色素苷提取量為指標，乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）為考察因素，進行4因素3水平的Box－Behnken Design（BBD）實驗設計，實驗因素水平見表1。響應面分析方案與結果見表2。利用Design－Expert 8．0．6軟件對實驗數據進行多元回歸擬合，獲得以五味子色素提取量為響應值的回歸方程：

提取量＝7．58－0．17A＋0．78B－1．63C＋0．1D－0．37AB－0．27AC＋0．032AD－0．32BC＋0．48BD＋0．76CD－0．79A2＋0．22C2＋1．12D2

表1 響應面實驗因素水平

表2 響應面分析方案及實驗結果

回歸模型方差分析結果顯示（表3）：該模型極顯著（P＜0．000 1），失擬項不顯著（P＞0．05），回歸模型的決定系數R2＝0．994 9，調整系數，說明該模型與實際擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于五味子色素提取量的理論預測。從回歸方程系數顯著性檢驗可知，各因素對色素提取率的影響程度依次為：料液比＞提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度；交互項AB、AC、BC、BD、CD極顯著（P＜0．01）；二次項A2、B2、C2、D2對色素提取率有極顯著影響（P＜0．01）。

表3 回歸模型方差分析結果

2．3．2 響應面分析及最佳提取工藝研究

響應面優化主要是根據響應面的三維圖以及標準殘差圖來對影響響應值的獨立變量進行進一步的分析，從3D圖中可以很直觀的看出各個變量之間的交互作用對結果的影響。五味子色素提取工藝優化的響應面及等高線見圖5，圖5列出了自變量極顯著（P＜0．01）的3項AB、BD、CD，直觀地反映了各因素對提取量響應值的影響。

圖a表示提取時間、乙醇濃度及兩者交互作用對五味子色素提取量的影響。從圖中可以看到，當乙醇濃度一定時，隨著提取時間的延長，色素提取量逐漸增加；當提取時間一定時，隨著乙醇濃度的提高提取量先增大后減小。

圖b表示提取時間、提取溫度及兩者交互作用對五味子色素提取量的影響。從圖中可以看出，當提取時間一定時，五味子色素提取量隨溫度的上升先降低，后逐漸上升；當提取溫度一定時，色素提取量隨提取時間的延長而增長。

圖c表示料液比、提取溫度及兩者交互作用對五味子色素提取量的影響。從圖中可以看出，當提取溫度一定時，隨著液體相對量的增大五味子色素提取量持續下降，當料液比一定時，五味子色素提取量隨著提取溫度的提高先下降后上升。

圖5 各因素交互效應對五味子色素提取量影響的曲面圖

運用Design Expert 8．0．6的響應面分析軟件對實驗結果進行優化，得到五味子色素的最優條件是：提取時間80 min，乙醇濃度53．26%，料液比1∶20 g／mL，提取溫度80℃，此時，五味子色素提取量預測達到最大值，為11．939 9 mg／L。為符合實際操作，將上述最優提取條件簡化為：提取時間80 min，乙醇濃度55%，料液比1∶20 g／mL，提取溫度80℃，按此提取工藝提取五味子色素，進行三次重復實驗，得到提取量的平均值為11．89 mg／L，與預測值接近，說明響應面優化得到五味子色素的提取工藝在實踐中可行。

2．4 五味子色素穩定性的研究

由于五味子色素目前暫無標準品作為對照，因此，以不同條件下的色素提取液的色度為指標來檢測其穩定性的變化。

2．4．1 光照對色素穩定性的影響

以色度為指標，檢測在不同光照條件下色素穩定性的變化，結果如圖6所示，在紫外光及室內散光的條件下，五味子色素的色度均有上下波動變化，但變化不大，說明光照對五味子色素穩定性影響不大。

圖6 光照對色素穩定性的影響

2．4．2 蔗糖對色素穩定性的影響

將色素提取液配制成不同濃度的蔗糖溶液，以色度為指標，檢測其穩定性。結果如圖7所示，當蔗糖濃度為0時色素色度值隨時間變化有小幅度波動，隨著蔗糖濃度的增大波動幅度降低，當濃度達到8%時，色素色度隨時間延長有穩定上升趨勢，可能是由于糖與花色素苷類色素結合形成穩定的絡合物導致的，這說明一定濃度的蔗糖可對五味子色素起到增色作用［23］。

圖7 蔗糖對色素穩定性的影響

2．4．3 過氧化氫對色素穩定性的影響

配制不同濃度的過氧化氫色素溶液，通過測量色素色度考察過氧化氫對色素穩定性的影響，結果如圖8所示，色素溶液的色度隨時間的延長逐漸下降，且隨過氧化氫濃度的增加下降的幅度加大，一定時間后趨于穩定，溶液顏色變淺。這說明五味子色素的耐性較差，這與文獻中報道［23］的分子氧對花色苷具有毒害作用相符。作用機理是氧可以通過直接氧化或間接氧化使花色苷降解，從而改變花色素苷的結構及性質。

圖8 過氧化氫對色素穩定性的影響

2．4．4 抗壞血酸對色素穩定性的影響

在添加不同濃度的抗壞血酸條件下，檢測抗壞血酸對五味子色素穩定性的影響，結果如圖9所示。隨著抗壞血酸濃度的增加，色素的色度逐漸增加，且隨時間的延長變化不大，由此說明抗壞血酸對五味子色素有增色作用，可作為增色劑和穩定劑添加到色素中。這一結果與文獻中報道［24］的抗壞血酸對花色苷具有穩定作用相符合。

圖9 抗壞血酸對色素穩定性的影響

2．4．5 pH值對色素穩定性的影響

將五味子色素液調節到不同pH值，通過觀察顏色變化研究pH值對五味子色素穩定性的影響。考察結果如表4所示，pH為1～3時色素顏色為鮮紅色不改變，pH為4～6時略有變淺為淺紅色，pH為7～9時為淺粉紅色，當pH＞10時，色素呈現棕色，且隨pH值增大顏色加深。說明五味子色素在酸性、中性和弱堿性條件下較穩定，且酸性越大，色素越紅，在強堿性條件下色素不穩定。這與文獻［25］中報道的花色素苷類色素的酸堿穩定性變化相符。

表4 不同pH值對色素穩定性的影響

2．4．6 金屬離子對色素穩定性的影響

以色素色度為指標，研究不同金屬離子對五味子色素的影響。結果如表5所示，Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋對色素穩定性無明顯影響；Al3＋對色素穩定性有破壞作用；Fe3＋、Cu2＋對色素穩定性有保護作用。因此，Fe3＋和Cu2＋可作為穩定劑添加到五味子色素產品中。

表5 金屬離子對五味子色素的影響

3 結論

本實驗采用經典的有機溶劑提取法，選取乙醇作為提取溶劑提取五味子色素，通過對提取時間、料液比、乙醇濃度和提取溫度單因素實驗和響應面分析，確定五味子色素的最佳提取工藝：以55%濃度乙醇為提取液，按1∶20 g／mL的料液比，在80℃下提取80 min，五味子色素提取量可達到最大，為11．89 mg／L。

穩定性實驗結果表明，五味子色素光穩定性較好；蔗糖、抗壞血酸對色素有穩定、增色作用；色素易被過氧化氫氧化；在酸性、中性和弱堿性條件下較穩定，強堿條件下顏色改變；Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋對色素穩定性無明顯影響，Al3＋對色素穩定性有破壞作用，Fe3＋、Cu2＋對色素穩定性有保護作用。

實驗結果表明，五味子色素可作為著色劑廣泛應用于各類食品、藥品、化妝品等與人類生活息息相關的產品中，同時，由于五味子色素產自天然植物的特性，使五味子色素的使用更安全放心。

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Optimization of extraction process of Schisandra pigment and its stability

WANG Shan－shan1，GU Wu1，XU Ru1，LI Tai－ya1，WANG Bin－chen2
（1．College of Life Engineering，Shenyang Institute of Technology，Fushun Liaoning 113122；2．School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Liaoning Dalian 116034）

The extraction technology of Schisandra pigment was optimized by response surface method on the basis of single factor experiment with anthocyanin from Schisandra pigment extract as index and ethanol concentration，extraction time，solid－liquid ratio and extraction temperature as factors．The pigment stability was studied with chroma as index．The results showed that：with the ethanol of concentration of 55%as the extracting solution，the solid－liquid ratio 1∶20 g／mL，extracted for 80 min at 80℃，the amount of pigment extracted from the fruit can reach the maximum of 11．89 mg／L．The pigment stability experiments showed that light stability was good；sucrose and ascorbic acid were of stable and hyperchromic effect；the pigment was oxygenated easily by hydrogen peroxide，and was stable in acidic，neutral and alkalescent conditions；the pigment changed color under alkali conditions；Ca2＋，Mg2＋，Na＋，K＋had little effect on the stability of the pigment，Al3＋had damaging effect on the stability of the pigment，and Fe3＋and Cu2＋had protective effect on the stability of the pigment．

Schisandra pigment；extraction；response surface analysis；stability

R 284．2

A

1007－7561（2017）02－0078－07

2016－07－18

省級大學生創新創業項目（20163201000017）

王珊珊，1984年出生，女，講師．