番茄紅素對山羊精液冷凍保存效果的影響

王艷華，朱海鯨，韓 聰，胡 珊，胡建宏

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.拉薩市動物疫病預防控制中心，拉薩 850000；3.榆林學院，陜西省陜北絨山羊工程技術研究中心，陜西榆林 719000)

番茄紅素對山羊精液冷凍保存效果的影響

王艷華1,2，朱海鯨3，韓 聰1，胡 珊1，胡建宏1

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.拉薩市動物疫病預防控制中心，拉薩 850000；3.榆林學院，陜西省陜北絨山羊工程技術研究中心，陜西榆林 719000)

為研究番茄紅素對山羊精液冷凍保存效果的影響，在山羊精液冷凍稀釋液中添加不同質量濃度(0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL)的番茄紅素，檢測冷凍-解凍后精子的活率、頂體完整率、質膜完整率、線粒體活性，并用試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。結果表明，1.0 mg/mL組的冷凍保存效果最好，精子活率、頂體完整率、質膜完整率和線粒體活性分別達到52.04%、51.33%、53.57%和49.31%，顯著高于對照組，且SOD、CAT、GSH-Px 的活性也顯著高于對照組；0.5 mg/mL組與2.0 mg/mL組的精子活率、頂體完整率、質膜完整率、線粒體活性及CAT和GSH-Px活性差異不顯著；4.0 mg/mL組的精子活率、頂體完整率、質膜完整率、線粒體活性及SOD和CAT活性與對照組差異不顯著。因此，在山羊精液冷凍稀釋液中加入1.0 mg/mL的番茄紅素對山羊精液具有顯著的保護作用，能進一步提高山羊凍精品質。

番茄紅素；山羊；精液；冷凍保存；精液品質

精液冷凍保存技術解決了精液長期保存的問題，使采精和受精在時間和空間上產生分離，延長精子的體外存活時間，最大限度地提高優秀種公畜的利用率，縮短品種改良周期。但精液冷凍保存過程對精子造成的物理性損傷、化學性損傷和氧化應激損傷使山羊精液冷凍保存技術的推廣受到很大限制，其中，氧化應激損傷最大，引起精子氧化應激的最主要因素是過量活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的產生。生物體內自身有一套抗氧化體系，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)能及時清除產生的ROS，因此，正常生理狀態下ROS的產生和消除處于動態平衡。精子在冷凍-解凍過程中，由于內外環境的刺激，使產生的ROS超過精子內抗氧化酶的抵御能力，造成ROS累積，從而破壞ROS的動態平衡，含有高濃度不飽和脂肪酸(PUFA)的精子質膜就極易遭受脂質過氧化損傷[1]，甚至引起精子DNA鏈的斷裂[2]，導致精子死亡，而死亡精子會產生更多的ROS，形成惡性循環，最終導致解凍后的精液品質下降，從而影響精子的受精能力。為降低在冷凍保存過程中ROS對精液品質的影響，通常會在冷凍稀釋液中加入外源的抗氧化劑。研究表明，在精液冷凍稀釋液中加入維生素E[3]、維生素C[4]、硫辛酸[5]、谷胱甘肽[6]等抗氧化物質可有效提高精子細胞中抗氧化酶的活性，提高冷凍-解凍后的精子活率。Mangiagalli等[7]發現補飼番茄紅素能有效提高低溫保存的兔精子活率，并能作為一種抗氧化劑替代維生素E和維生素C廣泛應用于動物生產。

番茄紅素是一種重要的類胡蘿卜素，具有抗氧化、抗衰老、抑制癌細胞增殖等多種功能[8]，是目前在自然界植物中發現的最強抗氧化劑之一，它是類胡蘿卜素中最有效的單線態氧淬滅劑[9]，清除氧自由基速率是維生素E的100倍[10]。目前，已有研究報道番茄紅素能提高人[11]、兔[12]、牛[13-14]、雞[15-16]等動物精液的冷凍保存效果。采用口服番茄紅素的方法對特發性男性不育癥患者進行治療后，患者的精液濃度和精子活力得到提高[17]，在雞、兔的日常飲水中添加番茄紅素可提高雞精液低溫保存后的精子活率[15]，降低兔精子凍融后的DNA損傷[12]。Bucak等[14]認為，在公牛精液冷凍稀釋液中添加番茄紅素可以顯著提高精子活率和線粒體活性。但在山羊精液冷凍稀釋液中添加番茄紅素的研究尚未見報道，為研究番茄紅素對山羊精液冷凍保存效果的影響，本試驗采集3～4歲陜北白絨山羊的精液，在冷凍稀釋液中添加不同質量濃度的番茄紅素，通過測定冷凍-解凍后精子的活率、質膜完整率、頂體完整率、線粒體活性及相關抗氧化酶活性，篩選出添加番茄紅素的適宜質量濃度，以期為山羊精液冷凍保存技術的廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑及藥品 果糖(北京百瑞金生物科技有限公司)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，天津市瑞金特化學品有限公司)、檸檬酸鈉(天津市瑞金特化學品有限公司)、檸檬酸(西安灞橋區化學試劑廠)、二甲基亞砜(Amresco 0231)、羅丹明123(R-8004，Sigma)、碘化丙啶(P4170，Sigma)、番茄紅素(Solarbio)、異硫氰酸酯熒光素標記的花生凝集素(Genmed，美國)。

1.1.2 試驗動物 精液采自榆林陜北白絨山羊試驗基地5只健康、繁殖性能好的陜北白絨山羊種公羊(3～4歲)。

1.1.3 冷凍稀釋液的配制 基礎稀釋液：Tris 300 mmol/L，檸檬酸95 mmol/L，果糖28 mmol/L，超純水100 mL，混勻，4 ℃保存，備用。

冷凍稀釋Ⅰ液：精液稀釋前，在基礎稀釋液中添加青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素0.4 g/mL和φ=15%的卵黃。將配好的精液冷凍稀釋Ⅰ液平均分裝在5個離心管中，每個管中分別添加番茄紅素，質量濃度分別為0(對照組)、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

冷凍稀釋Ⅱ液：在稀釋Ⅰ液的基礎上添加φ=5%的甘油。

1.1.4 其他溶液的配制 精子低滲液：0.49 g檸檬酸鈉和0.9 g果糖溶于100 mL雙蒸水中。

碘化丙啶(PI) 貯存液：0.000 2 g PI溶于 10 mL的PBS 中，0.45 μm濾膜過濾后，-20 ℃避光貯存。

羅丹明123(Rh123)貯存液：0.000 2 g Rh123溶于1 mL DMSO，0.45 μm 濾膜過濾后，避光貯存。

1.2 試驗方法

1.2.1 精液的采集與處理 采用假陰道法采集種公羊精液，在1 h內運回實驗室，自然降至室溫，進行常規品質檢查，精子活力達到0.8以上方可用于冷凍保存。

1.2.2 精液的第1次稀釋與平衡 將檢測合格的精液加入2倍體積的冷凍稀釋Ⅰ液，經多層紗布包裹后，于4 ℃冰箱中降溫平衡2 h。

1.2.3 精液的第2次稀釋與平衡 將第1次稀釋和平衡后的精液加入2倍體積等溫的(4 ℃)冷凍稀釋Ⅱ液進一步稀釋，使精液與稀釋液的最終體積比為1∶4，經多層紗布包裹后，4 ℃冰箱中平衡1.5 h。

1.2.4 精液的冷凍與解凍 在4 ℃環境下，將精液分裝于0.25 mL的冷凍細管，然后將封裝好的細管放入程序冷凍儀，以 1 ℃/min 的速率從 5 ℃降至-5 ℃，當溫度恒定在-5 ℃時，取出細管并迅速置于液氮面上方2～3 cm處，熏蒸6～8 min，熏蒸結束后迅速將細管投入液氮罐冷凍保存。2周后小心取出冷凍細管，投入37 ℃水浴，30 s解凍。

1.3 凍后精子質量指標的測定

1.3.1 活率 吸取解凍孵育后的精液樣品10 μL于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于37 ℃恒溫載物臺上，400×光學顯微鏡下觀察5個視野，每個視野至少統計200個精子，直線運動精子數占總精子數的百分比為精子活率。

1.3.2 頂體完整率 采用異硫氰酸酯熒光素標記的花生凝集素(FITC-PNA)染色方法檢測解凍后精子的頂體完整率。吸取解凍孵育后的精液樣品30 μL均勻涂抹于載玻片上，待自然干燥后，甲醇固定10 min，然后加入10 μL FITC-PNA 染液，37 ℃潮濕環境下避光孵育30 min，PBS沖洗2次，空氣干燥，用無色指甲油封片，于熒光顯微鏡下觀察，頂體被染為綠色的精子為頂體功能完整的精子，計算精子頂體完整率。

1.3.3 質膜完整率 采用低滲腫脹(HOST)試驗進行檢測。取20 μL解凍孵育后的精液樣品中加入等溫HOST低滲溶液200 μL，混勻，37 ℃孵育1 h后，取10 μL均勻涂抹于載玻片上，在400×倒置顯微鏡下觀察5個視野，尾部彎曲的精子為質膜完整的精子，彎尾精子的百分比即為質膜完整率。

1.3.4 線粒體活性 在試管中分別加入1 μL PI貯存液和1 μL Rh123貯存液，避光培養 10 min。吸取解凍孵育后的精液樣品50 μL加入避光培養的PI和Rh123混合液，培養30 min，取 10 μL 樣品制片，然后在 400×倒置顯微鏡下觀察。活精子和有活性線粒體的精子頭部不發光，而尾巴線粒體部分有綠色熒光，以此計算完整線粒體精子的百分率。

1.3.5 凍后精子抗氧化酶活性的測定 精液中SOD、CAT和GSH-Px的酶活性采用南京建成生物科技公司生產的試劑盒檢測，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 數據處理

數據采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，數據以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度的番茄紅素對山羊精液冷凍效果的影響

如表1所示，基礎液中添加1.0 mg/mL番茄紅素的冷凍保存效果最好，凍融后山羊精子活率、頂體完整率、質膜完整率和線粒體活性均顯著高于對照組(P<0.05)，其中，精子活率和線粒體活性與2.0 mg/mL組無顯著差異(P>0.05)；添加0.5 mg/mL番茄紅素時，精子活率和頂體完整率與對照組無顯著差異(P>0.05)，質膜完整率和線粒體活性與對照組差異顯著(P<0.05)；添加2.0 mg/mL番茄紅素時，各項指標均與對照組差異顯著(P<0.05)；添加4.0 mg/mL番茄紅素時，各項指標與對照組均差異不顯著(P>0.05)，精子活率和線粒體活性低于對照組。

表1 不同質量濃度番茄紅素下山羊精液的冷凍保護效果Table 1 Effects of different mass concentration of lycopene on freezing of goat semen

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values in the same column marked with different lowercase letters means significant difference (P<0.05).

2.2 不同質量濃度的番茄紅素對山羊精子凍后SOD、CAT 和 GSH-Px 活性的影響

由圖1-A可知，凍融后精漿中SOD活性在番茄紅素的添加量為0.5、1.0 mg/mL時與對照組差異顯著(P<0.05)，而2組間無顯著差異(P>0.05)，2.0 mg/mL組和4.0 mg/mL組與對照組差異不顯著(P>0.05)；由圖1-B可知，添加1.0 mg/mL番茄紅素時CAT活性最高，與對照組差異顯著(P<0.05)但與0.5 mg/mL組無顯著差異(P>0.05)，2.0 mg/mL組和4.0 mg/mL組則與對照組無顯著差異(P>0.05)；由圖1-C可知，添加0.5、1.0 和2.0 mg/mL番茄紅素均能提高GSH-Px活性，其中1.0 mg/mL組和2.0 mg/mL組顯著高于對照組(P<0.05)，但2組間無顯著差異(P>0.05)，4.0 mg/mL組顯著低于對照組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 稀釋液中添加番茄紅素對山羊精液凍后精子活率及質膜和頂體完整率的影響

本研究中，在山羊精液冷凍稀釋液中添加0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的番茄紅素時，雖然對凍后精液品質都有改善作用，但只有添加1.0 mg/mL 時效果最顯著，這與Uysal等[17]的研究結果類似。原因可能有以下兩方面：一方面由于山羊精子膜含有高質量濃度的不飽和脂肪酸，冷凍過程中極易遭受ROS的攻擊[1]，而番茄紅素是一種脂溶性的抗氧化物，脂溶性物質對細胞膜上的磷脂有特殊親和性，占有膜上特殊位置，預防或阻止細胞膜上氧化反應的發生，從而保護精子膜不被氧化損傷，提高凍融后精子的質量；另一方面，范遠景等[18]研究指出，番茄紅素能夠上調內源性抗氧化酶的活性(SOD、CAT和GSH-Px)，而這些抗氧化酶能夠減少或清除精液在冷凍-解凍過程中產生的過量ROS，從而減輕精子遭受脂質過氧化損傷的程度， SOD、CAT和GSH-Px活性的提高與本研究結果相似。但Bucak等[14]研究發現，在公牛精液冷凍稀釋液中添加1.0 mg/mL的番茄紅素對凍融后精子活率、頂體完整性并無明顯影響，線粒體活性卻顯著提高，其原因一方面可能是山羊精子與公牛精子結構或生物學特性差異造成，因為不同物種的精子內自身抗氧化酶系統對ROS的抵御能力不同，精子所遭受的氧化應激程度不同[19]，因此，相同質量濃度的抗氧化劑對凍精的作用也會不同；另一方面可能是精子活率、頂體完整率以及線粒體活性的測定方法不同。

圖中小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05) Different lowercase letters marked on black bar means significant difference at P<0.05

本研究中，隨著番茄紅素添加質量濃度的增加，山羊精液的冷凍保存效果反而下降，這與Uysal等[17]的研究結果類似，說明番茄紅素對精液品質的影響具有劑量依賴性，Rosato等[16]的研究也證明這一點。本研究中，當番茄紅素添加質量濃度高于2.0 mg/mL時，雖能改善凍融后精子品質，但是效果不及1.0 mg/mL組，原因一方面可能是山羊精子膜含有的大量不飽和脂肪酸使其滲透性增強，脂溶性的番茄紅素更易進入細胞內部，而高質量濃度的番茄紅素對精子有毒性[17]；另一方面可能是高質量濃度的番茄紅素在溶液中聚集或結晶，而結晶的番茄紅素不易溶解，改變了精子細胞的滲透壓，從而損傷細胞。同樣，低質量濃度的番茄紅素對山羊精液的冷凍也不能起到很好的保護作用。

3.2 稀釋液中添加番茄紅素對精漿中抗氧化酶活性的影響

番茄紅素能夠輔助精子自身的抗氧化系統，減少自由基對精子的氧化損傷，進而改善凍融后的精子功能[16]。Rosato等[16]研究指出，番茄紅素能夠降低火雞凍精細胞的脂質過氧化損傷程度。然而，本研究中，隨著番茄紅素添加量的增加，精漿中抗氧化酶活性出現降低趨勢，當添加4.0 mg/mL的番茄紅素時，SOD和CAT活性與對照組無顯著差異，GSH-Px活性顯著低于對照組，說明高質量濃度的番茄紅素抑制抗氧化酶活性，推測可能與番茄紅素潛在的促氧化作用有關。某些特定條件下，類胡蘿卜素(CAR)可與ROS(ROO-)反應生成具有更強氧化性的過氧化自由基(CAR-OO-)[20]，加重細胞氧化損傷，導致抗氧化酶活性降低。Yeh等[21]以偶氮二異庚腈(AMVN)作為 Hs68 細胞的自由基生成劑，發現一定水平的番茄紅素可促進脂質過氧化反應的發生，這提示在應用番茄紅素作為抗氧化物質時，應注意其潛在的促氧化作用，調整番茄紅素的用量，篩選出最適宜的添加量。本研究結果表明，當番茄紅素添加量高于2.0 mg/mL時，SOD、CAT和GSH-Px的活性均顯著低于1.0 mg/mL組，可能在此質量濃度時番茄紅素已經表現出促氧化作用，當番茄紅素添加量低于0.5 mg/mL時，SOD、CAT和GSH-Px的活性也明顯低于1.0 mg/mL組，因此，番茄紅素的適宜添加量為 1.0 mg/mL。

4 結 論

番茄紅素對陜北白絨山羊冷凍精子具有較好的冷凍保護作用，能明顯提高山羊凍精解凍后的活率、頂體完整率、質膜完整率、線粒體活性及抗氧化酶活性，減緩冷凍對精子的損傷程度，其最適添加質量濃度為1.0 mg/mL。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Effects of Lycopene on Cryopreservation of Goat Semen

WANG Yanhua1,2,ZHU Haijing3,HAN Cong1,HU Shan1and HU Jianhong1

(1.College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;2.Animal Disease Prevention and Control Center of Lhasa City,Lhasa 850000,China; 3.Shaanxi Province Research Center for Engineering & Technology of Shanbei Cashmere Goat Yulin University,Yulin Shaanxi 719000,China)

The aim of this study is to determine the effects of different amounts of lycopene(0 mg/mL,0.5 mg/mL,1.0 mg/mL,2.0 mg/mL,4.0 mg/mL) added to cryopreservation extender on the post-thawed sperm parameters (motilities,acrosome integrity,plasma integrity and mitochondrial activity) and antioxidant activities (SOD,CAT and GSH-Px) of sperm of white cashmere goat from Shanbei .The results showed that addition of lycopene was 1.0 mg/mL,the motility (52.04%),acrosome integrity (51.33%),plasma membrane integrity (53.57%) and mitochondrial activity(49.31%) were increased significantly and also had significant differences in enzyme activity of SOD,GSH-Px and CAT compared with the control group.For 0.5 mg/mL group and 2.0 mg/mL group,the motility,acrosome integrity,plasma membrane integrity,mitochondrial activity and CAT,GSH-Px activity were no significant difference between them.For 4.0 mg/mL group,the motility,acrosome integrity,plasma membrane integrity,mitochondrial activity and SOD,CAT activity were significantly lower than that of control group.The results of this study showed that lycopene supplementation in semen extenders was of greater benefit to sperm of frozen-thawed goat sperm,the best mass concentration was 1.0 mg/mL.

Lycopene; Goat; Semen; Cryopreservation; Semen quality

WANG Yanhua,female,master student.Research area:animal biological technology.E-mail: 634148126@qq.com

HU Jianhong,male,professor,doctoral supervisor.Research area: livestock reproductive and physiological regulation.E-mail: hjh19732008@126.com

日期：2017-03-03

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0836.076.html

2016-03-19

2016-05-17

國家絨毛用羊產業技術體系(CARS-40-13)；陜西省科技統籌創新工程計劃(2014KTDZ02-01，2015KTTSNY04-03)。

王艷華，女，碩士研究生，從事動物生物技術研究。E-mail: 634148126@qq.com

胡建宏，男，教授，博士生導師，主要從事家畜生殖生理調控研究。E-mail: hjh19732008@126.com

S814.8

A

1004-1389(2017)03-0336-06

Received 2016-03-19 Returned 2016-05-17

Foundation item Sheep for Cashmere and Wool Industry Technology System (No.CARS-40-13);Shaanxi Science and Technology Co-ordinate Innovation Project (No.2014KTDZ02-01,No.2015 KTTSNY04-03).