河南某雞場地方品種雞禽白血病病毒感染狀態檢測

張桂枝，靳雙星，黃炎坤

(河南牧業經濟學院 動物科技學院，鄭州 450046)

河南某雞場地方品種雞禽白血病病毒感染狀態檢測

張桂枝，靳雙星，黃炎坤

(河南牧業經濟學院 動物科技學院，鄭州 450046)

為了解河南某雞場地方品種雞禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)感染狀態，采集該雞場綠殼蛋雞、青腳麻雞和固始雞的泄殖腔棉拭子、蛋清和血清，利用ELISA方法檢測泄殖腔棉拭子、蛋清和血清樣品中的ALV-p27抗原及血清樣品中ALV-A/B和ALV-J抗體的水平，同時采集其血液接種DF-1細胞進行外源性ALV的分離鑒定。結果表明，綠殼蛋雞泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中的ALV-p27抗原陽性率分別為23.55%、11.96%和26.63%，血清中ALV-A/B和ALV-J抗體的陽性率分別為30.43%和16.85%，外源性ALV的分離陽性率為13.04%；青腳麻雞泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原陽性率分別為 10.99%、5.43%和22.83%，血清中ALV-A/B和ALV-J抗體的陽性率分別為18.48%和6.52%，外源性ALV的分離陽性率為8.00%；固始雞泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原陽性率分別為21.07%、12.32%和25.00%，血清中ALV-A/B和ALV-J抗體的陽性率分別為28.26%和17.39%，外源性ALV的分離陽性率為12.50%。表明3個地方品種雞都不同程度地感染外源性ALV，且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種亞群同時感染。

地方品種雞；禽白血病；p27抗原；A/B抗體；J抗體

禽白血病(Avian Leukosis ,AL)是由禽白血病病毒 (ALV)引起的以造血細胞增生為主的一類腫瘤性疾病。該病不僅引起感染雞不同內臟、不同組織腫瘤及皮膚血管瘤[1-4]；感染雞更多的表現為生長緩慢，產蛋率、受精率和孵化率降低[5-6]；同時會造成嚴重的免疫抑制[6]，使機體中樞免疫器官萎縮，機體抵抗力明顯下降，其他疾病繼發感染的幾率增加；而且可通過水平和垂直傳播途徑在雞群中傳播，給養雞業造成巨大的危害[1-6]。

近來，河南某雞場地方品種雞出現生長發育受阻、疫苗免疫失敗、死淘率增加、皮膚出現大小不等的血皰等現象；剖檢可見到肝、脾、腎腫大，出現腫瘤結節。根據臨床癥狀和病理變化疑似為禽白血病。為了解該雞場地方品種雞禽白血病病毒的感染狀況，選取有代表性的綠殼蛋雞、青腳麻雞和固始雞為研究對象，利用酶聯免疫吸收試驗(ELISA)檢測泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中的ALV-p27抗原，同時采集部分雞血清檢測ALV-J和ALV-A/B的抗體，了解感染禽白血病的亞群類型；并無菌采集部分雞血液接種對內源性E亞群ALV有抵抗性的DF-1細胞，培養9 d后取細胞上清液檢測ALV-p27抗原，以判斷雞群外源性ALV的感染情況，為實施中國優質地方品種雞的凈化和優質品種資源保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 160～175日齡綠殼蛋雞6 072只，141～145日齡青腳麻雞5 060只，180日齡固始雞2 368只。

1.1.2 主要儀器設備 二氧化碳培養箱(Thermo公司 )，倒置顯微鏡，生物安全柜，酶標儀(Thermo公司)，微量加樣器等。

1.1.3 主要試劑 ALV- p27抗原檢測試劑盒為BioChek公司產品， ALV-A/B 和 ALV-J 抗體檢測試劑盒為IDEXX公司產品，DMEM培養液、新生牛血清、胰酶均為GIBCO公司產品。

1.1.4 細胞 DF-1細胞由河南農業大學畜禽傳染病實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1 泄殖腔棉拭子ALV- p27抗原檢測 采樣前在樣品管中加入1 mL樣品稀釋液(來源于試劑盒，成分為含有蛋白穩定劑和疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液)，無菌棉簽采集試驗雞泄殖腔棉拭子，與稀釋液混勻后冷凍。反復凍融2次，檢測前將樣品恢復至室溫，吸取50 μL上清液，加入到ELISA反應板中，按照ELISA試劑盒操作說明檢測樣品中ALV-p27抗原。以405 nm的波長測定陰性對照、陽性對照和樣品的吸光度，判定樣品的陰、 陽性。

1.2.2 種蛋ALV- p27抗原檢測 收集試驗雞的種蛋，每枚種蛋取1 mL蛋清反復凍融2次后保存，檢測前將樣品恢復至室溫，吸取50 μL蛋清液， 加入到ELISA反應板中，按照ELISA試劑盒操作說明檢測樣品中的ALV-p27抗原。

1.2.3 血清ALV-p27抗原檢測 采集試驗雞血液，凝固后4 000 r/min離心10 min，分離血清保存，備用。檢測時吸取50 μL血清，加入到ELISA反應板中，按照ELISA試劑盒操作說明檢測樣品中的ALV- p27抗原。

1.2.4 ALV特異性抗體檢測 用稀釋液將血清樣品做1∶500稀釋，然后參照ALV-A/B 和 ALV-J 抗體檢測試劑盒說明檢測樣品中ALV-A/B亞型和ALV-J亞型的抗體。

1.2.5 外源性ALV的分離鑒定 無菌采集抗凝血，接種于已長成單層的DF-1細胞，37 ℃ 繼續孵育2 h，棄上清液，更換為φ(新生牛血清)=1%的DMEM培養液，在37 ℃、φ(CO2)=5%條件下繼續培養9 d。然后冷凍，反復凍融2次后，用ELISA試劑盒檢測細胞培養液中的ALV- p27抗原，以確定是否存在外源性ALV感染。

2 結果與分析

2.1 綠殼蛋雞ALV感染情況

由表1可知，綠殼蛋雞泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中ALV- p27抗原陽性率分別為23.55%(1 430/6 072)、11.96%(33/276)、26.63%(49/184)。ALV-J亞型和ALV-A/B亞型2種抗體陽性率均較高，ALV-A/B達到30.43%，ALV-J也達到16%以上(16.85%)。統計分析結果顯示，2種抗體均為陽性的個體占15.28%；外源性ALV分離陽性率為13.04%(12/92)。結果表明，綠殼蛋雞雞群存在外源性的禽白血病病毒感染，且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種亞群同時感染的情況。

2.2 青腳麻雞ALV感染情況

由表2可知，青腳麻雞泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原陽性率分別為 10.99%(556/5 060)、5.43%(15/276)和22.83%(21/92)。ALV-A/B抗體陽性率為18.48%(17/92)，ALV-J抗體陽性率為6.52%(6/92)，部分個體2種抗體均為陽性。外源性ALV分離陽性率為8.00%(4/50)。說明青腳麻雞雞群中存在外源性禽白血病病毒感染，且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種亞群同時感染的情況。青腳麻雞的抗原陽性率和抗體陽性率都低于綠殼蛋雞。

表1 綠殼蛋雞ALV-p27抗原和ALV 抗體檢測Table 1 ALV-p27 antigenand ALV antibody test results of blue egg chicken

2.3 固始雞ALV感染情況

由表3可知，固始雞泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原陽性率為分別為21.07%(499/2368)、12.32%(34/276)和25.00%(23/92)。ALV-A/B抗體陽性率為28.26%(26/92)，ALV-J抗體陽性率為17.39%(16/92)，部分個體2種抗體均為陽性。外源性ALV分離陽性率為12.50%(5/40)。說明固始雞雞群存在外源性禽白血病病毒感染，且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種亞群同時感染。

表2 青腳麻雞ALV-p27抗原和ALV 抗體檢測Table 2 ALV-p27 antigenand ALV antibody test results of partridge shank chicken

表3 固始雞ALV-p27抗原和ALV 抗體檢測Table 3 ALV-p27 antigenand ALV antibody test results of gushi chicken

3 結論與討論

3.1 禽白血病病毒感染狀況

自20世紀90年代末J 亞群禽白血病傳入中國以來，流行和發病情況日趨嚴重，從早期的肉種雞感染，蔓延到蛋雞，再到國內很多的地方雞種[7-14]。本研究采集河南地區地方品種雞泄殖腔棉拭子、蛋清、血清等樣品檢測ALV的感染情況。通過研究發現，綠殼蛋雞、固始雞和青腳麻雞的泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中ALV-p27抗原陽性率均較高。同一批雞的泄殖腔棉拭子、蛋清和血清的ALV-p27抗原陽性率有差異，分析發現，某些個體泄殖腔棉拭子、蛋清和血清的ALV-p27抗原均為陽性，部分個體只有泄殖腔棉拭子抗原陽性或血清抗原陽性，而只有蛋清抗原陽性的個體不足1%。3 個地方品種雞均是血清抗原陽性率最高，其次是泄殖腔棉拭子，蛋清抗原陽性率最低。說明綠殼蛋雞、固始雞和青腳麻雞血液和泄殖腔帶毒率較高，蛋清帶毒率較低，但前者并不完全覆蓋后者。3 個品種雞間感染程度有一定差異，青腳麻雞較其他2 個品種雞感染輕微。

ALV特異性抗體水平反映雞群禽白血病病毒的感染情況以及感染過的主要亞群，對禽白血病的凈化有一定指示作用。從本研究的抗體檢測情況來看，綠殼蛋雞、固始雞和青腳麻雞血清中ALV-A/B和ALV-J抗體均檢出陽性個體，并且部分個體2種抗體均為陽性，其中綠殼蛋雞ALV-A/B抗體陽性率最高達30%以上，固始雞ALV-J抗體陽性率最高達17.39%，3個品種均是ALV-A/B抗體陽性率大于ALV-J抗體陽性率。說明3個地方品種雞同時存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種亞群同時感染的可能，ALV-A/B 亞群感染率大于ALV-J亞群 。研究結果與常維山等[8]報道的地方品種雞群中ALV-J 亞型和 A/B 亞型白血病病毒感染很普遍的結果一致，但與張勝斌等[14]報道的ALV-A/B 亞群抗體的總陽性率相對較低、J 亞群抗體的總陽性率較高有差異。

3.2 內、外源禽白血病病毒的區分

ALV可分為內源性病毒和外源性病毒。雞的外源性ALV是指不會通過宿主細胞染色體傳遞的病毒，包括A、B、C、D和J亞群；內源性ALV通常指E 亞群ALV，是指可整合進宿主細胞染色體基因組的前病毒cDNA，因而可通過染色體垂直傳遞，但通常致病性或致瘤性很低或完全沒有。目前對禽白血病的防控主要采用對種雞群開展外源性ALV檢測凈化。DF-1細胞培養分離病毒被視為種雞群凈化的國際金標準，因為只有外源性 ALV可以在DF-1細胞系上生長，而內源性的 ALV-E 亞群不能在該細胞系上生長[3,7]。本研究將綠殼蛋雞、固始雞和青腳麻雞的血液分別接種DF-1細胞，培養9 d后，其細胞培養液中均檢測到ALV-p27抗原，外源性ALV的分離陽性率分別為13.04%、12.50%和8.00%，檢出率低于泄殖腔棉拭子和血清樣品，略高于蛋清樣品。結果表明3個地方品種雞均已感染外源性的禽白血病病毒。

從本研究的檢測結果看，ALV 在河南地方品種雞群中感染率較高。隨著致病力極強的ALV-J的出現及廣為傳播，加之針對該病又無可用免疫疫苗，其感染的雞不斷出現患瘤死亡、生產性能下降和免疫抑制等，不僅對原種雞的生產產生消極影響，對父母代種雞造成的破壞更是呈指數級增大。因此，根據地方品種雞的特點，制定合理的凈化方案，加強地方品種雞禽白血病的凈化已迫在眉睫。

Reference：

[1] 張小桃,史偉偉,劉紅波,等.血管瘤相關J亞群禽白血病病毒ZH-08株的分離與全基因組序列測定[J].畜牧獸醫學報，2010,41(2):193-199.

ZHANG X T,SHI W W,LIU H B,etal.Isolation and the full-length genome sequencing of subgroup J avian leukosis virus ZH-08 isolate associated with hemangioma[J].ActaVeterinariaetZootcchnicaSinica,2010,41(2):193-199(in Chinese with English abstract).

[2] 張丹俊,趙瑞宏,沈學懷,等.黃羽肉雞J亞群禽白血病腫瘤及相關病變發生規律的研究[J].中國家禽,2013,35(20):17-19.

ZHANG D J,ZHAO R H,SHEN X H,etal.Tumors and related process induced by avian leukosis virus subgroup J in yellow-feather broilers [J].ChinaPoultry,2013,35(20):17-19(in Chinese with English abstract).

[3] 徐海鵬,孟凡峰,董 宣,等.種蛋中內源性禽白血病病毒的檢測和鑒定[J].畜牧獸醫學報,2014,45(8):1317-1323.

XU H P,MENG F F,DONG X,etal.Detection and identification of an endogenous subgroup E avian leukosis virus in a chicken breeder embryo[J].ActaVeterinariaetZootcchnicaSinica,2014,45(8):1317-1323(in Chinese with English abstract).

[4] 崔治中.禽白血病病毒研究的過去、現在和將來[J].生命科學,2012,24(4):305-308.

CUI ZH ZH.The past,present and future in the studies of avian leukosis viruses [J].ChineseBulletinofLifeSciences,2012,24(4):305-308(in Chinese with English abstract).

[5] 尹 月,蘭 茜,李天杰,等.J亞型禽白血病病毒對雞產蛋性能的影響[J].四川農業大學學報,2013,31(2):211-215.

YIN Y,LAN X,LI T J.etal.The effects of avian leukosis virus subgroup J on chicken laying performance [J].JournalofSichuanAgriculturalUniversity,2013,31(2):211-215(in Chinese with English abstract).

[6] 商營利,劉思當,丁寶君,等.雞感染J亞群禽白血病病毒的免疫抑制機理[J].中國獸醫學報,2005,25(6):573-577.

SHANG Y L,LIU S D,DING B J,etal.Immunosuppressive mechanism of broilers infected with avian leukosis virus subgroup[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2005,25(6):573-577 (in Chinese with English abstract).

[7] 王 波,李清源,劉紹瓊,等.皖南黃肉種雞種蛋中禽白血病病毒的感染狀態檢測[J].畜牧獸醫學報,2011,42(2):224-227.

WANG B,LI Q Y,LIU SH Q,etal.Evaluation on ALV infection in fertilized eggs from a wan-nan yellow-feather parent broiler breeder flock[J] .ActaVeterinariaetZootechnicaSinica,2011,42(2):224-227 (in Chinese with English abstract).

[8] 常維山,郭慧君,孫淑紅.近年來我國禽白血病流行現狀及發展趨勢分析[J].中國家禽,2010,32(1):8-10.

CHANG W SH,GUO H J,SUN SH H,etal.Analysis on the current situation and development trend of avian leukemia in China in recent years[J].ChinaPoultry,2010,32(1):8-10(in Chinese).

[9] 梁雄燕,楊玉瑩,顧玉芳,等.湖北部分肉種雞J亞群禽白血病血清學調查及PCR檢測[J].湖北農業科學,2009,48(11):2636-2638.

LIANG X Y,YANG Y Y,GU Y F,etal.Serological investigation and PCR detection for avian leukosis subgroup J in part of hubei meat-type chicken flocks[J].HubeiAgriculturalSciences,2009,48(11):2636-2638 (in Chinese with English abstract).

[10] 俞 燕,朱鴻媛,高明燕,等.地方雞種禽白血病病毒感染動態及檢測方法比較[J].中國家禽,2014,36(8):23-26.

YU Y,ZHU H Y,GAO M Y,etal.Dynamic change and different detection methods for avian leukosis virus in indigenous chickens during brooding and rearing periods[J].ChinaPoultry,2014,36(8):23-26 (in Chinese with English abstract).

[11] 高玉龍,邵華斌,羅青平,等.2009年我國部分地區禽白血病分子流行病學調查[J].中國預防獸醫學報,2010,32(1):32-35.

GAO Y L,SHAO H B,LUO Q P,etal.Molecular epidemiology of avian leukosis virus isolates from some regions of China in 2009[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine,2010,32(1):32-35 (in Chinese with English abstract).

[12] SUN S,CUI Z.Epidemiological and pathological studies of subgroup J avian leukosis virus infections in Chinese local “yellow” chickens [J].AvianPathoogyl,2007,36(3): 221-226.

[13] 孫 淼,李金彩,郭振華,等.J亞型禽白血病病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫雜志,2009,45(10): 46-48.

SUN M,LI J C,GUO ZH H,etal.Isolation and identification of avian leukosis virus subtype J[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine,2009 ,45(10): 46-48 (in Chinese with English abstract).

[14] 張勝斌,吳天威,韋 平,等.地方優良雞種禽白血病病毒感染調查及凈化[J].中國家禽,2010,32(12):11-16.

ZHANG SH B,WU T W,WEI P,etal.Investigation of avian leukosis virus infections and eradication practices in local lines of chickens[J].ChinaPoultry,2010,32(12):11-16 (in Chinese with English abstract).

(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Evaluation of ALV Infection in Henan Local Chicken Strains

ZHANG Guizhi,JIN Shuangxing and HUANG Yankun

(College of Animal Science and Technology,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China)

In order to understand ALV(Avian Leukosis Virus,ALV) infection status of local chicken strains in a chicken farm of Henan ,the Cloacal swab,egg-white and serum samples were collected from Henan blue egg chicken,partridge shank chicken and gushi chicken.ALV-p27 antigen of all samples and ALV-AB and ALV-J antibody of serum were directly detected by ELISA.The exogenous ALV was isolated and identified after DF1 cells were inoculated by blood.The results showed that positive rates of ALV-p27 antigen of Cloacal swabs,egg-whites and serumsin blue egg chicken was 23.55%,11.96% and 26.63%,positive rates of ALV-AB and ALV-J antibody of serums were 30.43% and 16.85%,and positive rate of exogenous ALV was 13.04%.The positive rates of ALV-p27 antigen of Cloacal swabs,egg-whites and serumsin partridge shank chicken was 10.99%,5.43% and 22.83%,positive rates of ALV-AB and ALV-J antibody of serums were 18.48% and 6.52%,and positive rate of exogenous ALV was 8.00%.The positive rates of ALV-p27 antigen of Cloacal swabs ,egg-whites and serums in gushi chicken were 21.07%,12.32% and 25.00%,positive rates of ALV-AB and ALV-J antibody of serums were 28.26% and 17.39%,and positive rate of exogenous ALV was 12.50%.Together,these data indicated that 3 breeds of local strains chicken were infected with exogenous ALV in different degrees and there may be chicken simultaneously inflected by 2 or 3 subtypes of ALV-A/B and ALV-J.

Local chicken strains; Avlan leukosis; p27 antigen; AB antibody; J antibody

ZHANG Guizhi,female,master,associate professor.Research area:animal disease prevention.E-mail: zhangguizhi666@126.com

日期：2017-03-03

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0836.072.html

2016-03-13

2016-06-12

河南省科技攻關計劃(152102110089)；校科技創新團隊項目(HUAHE2015003)。

張桂枝，女，副教授，碩士，主要從事畜禽疫病防治的研究。E-mail: zhangguizhi666@126.com

S831.7

A

1004-1389(2017)03-0350-05

Received 2016-03-13 Returned 2016-06-12

Foundation item Key Scientific and Technological Project of Henan Province(No.152102110089);Science and Technology Innovation Project of Henan University of Animal Husbandry and Economy(No.HUAHE2015003).