基于高通量測序技術的堆肥對蘭州百合根際微生物多樣性的影響

郝海婷，王若愚，趙 霞，王 筠，郭志鴻，張玉寶，謝忠奎

(1.中國科學院 寒區旱區環境與工程研究所 生態與農業研究室(皋蘭生態與農業綜合研究站)，蘭州 730000；2.甘肅省寒區旱區逆境生理與生態重點實驗室，蘭州 730000；3.中國科學院大學，北京 100049；4.中國科學院 寒區旱區環境與工程研究所 沙漠與沙漠化研究室，蘭州 730000)

基于高通量測序技術的堆肥對蘭州百合根際微生物多樣性的影響

郝海婷1,2,3，王若愚1,2,3，趙 霞1,2,3，王 筠3,4，郭志鴻1,2,3，張玉寶1,2,3，謝忠奎1,2,3

(1.中國科學院 寒區旱區環境與工程研究所 生態與農業研究室(皋蘭生態與農業綜合研究站)，蘭州 730000；2.甘肅省寒區旱區逆境生理與生態重點實驗室，蘭州 730000；3.中國科學院大學，北京 100049；4.中國科學院 寒區旱區環境與工程研究所 沙漠與沙漠化研究室，蘭州 730000)

以蘭州百合為試材，基于llumina MiSeq測序平臺，探討施用堆肥與化肥對蘭州百合鱗莖鮮質量及根際土壤細菌和真菌微生物群落的影響。結果表明，有機堆肥對增加百合鱗莖鮮質量作用顯著，相比化肥增產76.6%。物種注釋結果顯示，細菌的門、綱、目、科、屬的數量在施用堆肥的土壤中都大于施用化肥的土壤，而經施用化肥處理的土壤中的真菌各個分類水平的數量大于施用有機肥的。從豐富度指數(Chao1)和多樣性指數(Shannon)分析，細菌群落整體變化小于真菌群落的變化。施用有機肥或化肥的樣品，一些細菌屬的相對豐度變化不明顯，這些細菌屬包含的大多數菌是有益菌。此外，在有機堆肥組的樣品中出現一些有益特有菌屬，例如野野村菌屬(Nonomuraea)，而化肥組的樣品中發現致病特有菌屬(Aquicella)。在真菌屬中，鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)和支頂孢屬(Acremonium)的豐度在有機肥處理下顯著降低，這些屬分布有很多潛在或機會致病真菌，這在一定程度上說明施用有機肥能有效改善百合根際土壤微生物群落。

蘭州百合；有機堆肥；根際微生物；llumina MiSeq測序

土壤微生物是土壤生態系統中極其重要的組分[1]，是土壤生態系統養分循環和能量流動的動力，在維持系統的穩定性和可持續性中占主導地位[2]。現代農業生產中，土壤耕作方式、施肥和農藥是影響大田土壤微生物群落的結構組成和多樣性的三大主要因素。尤其是化肥的施用直接影響土壤理化性質，進而引起土壤微生物活性和群落多樣性的改變。研究發現長期施入氮肥明顯降低土壤微生物的活性[3]， 而向土壤中添加糞肥、植物殘體等有機肥可有效維持土壤肥力和微生物系統的穩定[4]。因此，不同的施肥處理對土壤微生物量、微生物活性、群落功能的影響也不相同。

蘭州百合是中國百合中的上品，具有很高的食用、藥用、保健和觀賞價值。然而，蘭州百合是多年生鱗莖草本植物，通常在籽球栽植后2～3 a才能生長成為成熟的商品球莖，生長發育過程中往往需要大量營養供給。當前蘭州百合種植中，普遍以施用化肥為主，有時少量施用農家肥。化肥的連續施用常常導致土質變差、營養元素失衡、土壤微生物多樣性降低，從而病原微生物大量滋生，土傳病害加重，因而易產生連作障礙，嚴重影響百合的生長發育、品質和產量[5]。

近年來，蘭州百合消費市場的不斷擴大，百合產業發展方向已開始從追求高產轉變到保證產品品質下的穩定生產。由于有機種植的蘭州百合鱗莖個頭碩大、肉質甜美，具有更高的經濟價值和市場歡迎度，部分生產者已開始投入資金增大農家肥用量，并通過綜合管理控制化肥及農藥的使用。當前有機肥的主要來源有2種：①畜禽糞便。由于存在腐熟周期長、制作成本高、勞動力投入較多等限制因素，將畜糞、秸稈等物質經過徹底的高溫有氧發酵，完全無害化處理措施以后施用的并不多。這類有機肥未經徹底腐熟，容易造成燒苗，并且在施用過程中難以殺滅雜草種子和病蟲害、寄生蟲的蟲卵，最終容易導致土壤中蟲害的發生，或商品種球遭到蟲卵污染。 ②商品有機肥。生產企業利用畜禽糞便、秸稈等，通過一定工藝制成有機肥顆粒，但商品有機肥由于生產成本的問題，依舊存在未完全腐熟的問題，依然在施用中不能發揮最大作用。目前，在日本、美國、埃及等有機種植產業中大規模采用機械化的完全腐熟的堆肥，并取得良好的經濟和社會生態效益[6-9]。

傳統的土壤微生物研究方法有微生物平板培養法、DNA指紋圖譜技術、Biolog鑒定系統法、生物標記法等[10-11]，但這些方法往往低估土壤微生物的群落組成，更無法詳細描述土壤微生物的群落結構組成方面的信息及不同群體之間的生理差異。隨著科學技術的迅速發展，高通量測序技術也隨之誕生。不同于傳統的測序方法，高通量測序技術的優勢在于不但極大地降低基因測序成本，實現大規模的土壤微生物基因的直接測序[12]，而且提高測序通量，極大地豐富試驗研究的信息量，使土壤微生物研究更為深入。

因此，本研究采用完全腐熟有氧發酵的方法制備堆肥施用于蘭州百合，以普通化肥作為對照組，采用高通量測序方法分析農田土壤微生物多樣性在施肥前后的變化，以及百合產量等，闡明完全腐熟發酵堆肥施用后的農田土壤微生態特征，從而為建立大規模百合有機堆肥完全腐熟發酵體系進行條件摸索和數據積累。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究地點位于寧夏回族自治區銀川市平吉堡中國科學院西北農業生物技術中心試驗田。該地區屬大陸性季風氣候，日照充足，干旱少雨，年均氣溫9.1 ℃，年降水量203 mm。土質多為灌淤土，熟化土層深厚，土質條件好，灌排通暢。

1.2 材料與取樣方法

百合品種采用甘肅地方食用品種‘蘭州百合’。百合苗齡1 a左右，行距20 cm，株距15 cm。試驗區面積0.133 hm2。

為促進堆肥完全腐熟，堆肥試驗中添加商品EM菌粉以增加發酵活力(廣州微元生物科技有限公司)。

供試堆肥材料：有機肥原料因地制宜，選用當地的雞糞和玉米秸稈。

堆肥：首先，將粉碎成約1 cm左右小段的玉米秸稈鋪20 cm厚，上面鋪1層雞糞(約5 cm)，雞糞上面撒1層EM菌粉，在適當的灑水。玉米秸稈和雞糞的質量比是2∶1。玉米秸稈加雞糞加EM菌一共重復疊加14層，高度約2.3 m。在堆制過程中，堆心溫度在剛開始的30 ℃左右開始升溫，10多天后，平均達到45 ℃左右，進行第1次翻料；且溫度持續增漲，溫度最高達到67 ℃。期間每10 d左右陸續進行3～4次翻料后堆體溫度不再上升，逐漸冷卻至30 ℃以下，視為完全腐熟。整個發酵過程持續2個月左右至完全腐熟，發酵結束。

田間設計：設化肥(lilyW)和EM菌發酵有機肥(lilyY)2個處理。化肥(lilyW)作為對照，主要包括氮肥和磷肥(美國產磷酸氫二銨)。在1 a生百合苗的2塊試驗地中分別施用化肥和有機肥，其他農田管理措施相同。堆肥 2 000 kg/667m2，化肥為磷酸氫二銨20 kg/667m2。2014年3月下旬作為基肥施用。

采樣：分別在化肥和有機肥處理的百合試驗田，隨機選取3個百合根際土樣。迅速將土樣保存于帶有冰袋的保溫箱中，帶回實驗室，凍存于-20 ℃冰箱保存，備用。另外，在對化肥和有機肥處理的百合根際土壤進行采樣時，將對應的百合種球也一并取回，稱鮮質量。

1.3 土壤微生物 DNA的提取

土壤總DNA的提取：土壤總DNA的提取采用美國OMEGA公司生產的E.Z.N.A.Rhizosphere soil DNA Kit試劑盒。將提取的土壤總DNA電泳和NanoDrop 2000TM分光光度計(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)檢測合格后，取自同一肥料處理的3個根際土壤樣品DNA等量混合作為1個測序樣本。將混合好的化肥處理的根際土樣(lilyW)和有機肥處理的土樣(lilyY)，再次進行質量檢測，密封，然后用冰袋寄送到北京諾禾致源生物信息科技有限公司(www.novogene.com)進行測序。

1.4 試驗上機流程

整個上機流程包括PCR的擴增、PCR產物的混樣、純化，文庫的構建和上機測序流程由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供。高通量測序技術具有測序深度高、利于鑒定低豐度群落物種以及費用低的特點，已成為研究微生物群落多樣性的首選之策[13-14]。因此，在本試驗中，基于Illumina MiSeq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法對16S rDNA高變區V3～V5區和ITS1區域進行測序。

1.5 測序數據分析

為了研究樣品的物種組成多樣性信息，用 Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)[15]對所有樣品的全部 Effective Tags 序列聚類，默認提供以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs( Operational Taxonomic Units )結果。

同一OTUs中的序列被視為是來源于某1個相同分類單元的序列，作為1個假定的分類單元。Uparse 構建 OTUs 時會選取代表性序列(依據其算法原則，篩選的是OTUs中出現頻數最高的序列)，將這些代表性序列集合用RDP Classifier(Version 2.2，http:// sourceforge.net/ projects/ rdp-classifier/)[16]與GreenGene數據庫(http:// greengenes.lbl.gov/ cgi-bin/ nph-index.cgi)[17]進行物種注釋分析。根據物種注釋，統計每個樣品在各分類水平(Kingdom,Phylum,Class,Order,Family,Genus,Species)上的數目。根據物種注釋結果，選取在門(Phylum)分類水平上最大相對豐度排名前10的門，生成的物種相對豐度分布柱。

對不同樣品在不同一致性(Identity)閾值水平(默認提供97%的閾值)下的Alpha Diversity 分析的指數進行統計。其中，97%水平下聚類成為1個OTU的序列被認為可能是源自于同1個種的(Species Boundary)的序列。主要考察2個指標：Species Richness Estimators和Community Diversity Indices。Species Richness Estimators 是用來估計群落樣品中包含的物種總數，Chao1 指數[18]是廣泛使用的指數之一。Community Diversity Indices 是包含樣品中的物種組成的豐富度(Richness)和均勻度(Evenness)2個因素的評估指標，廣泛采用的計算參考是 Shannon指數(Shannon’s diversity index)。此外，稀釋曲線(Rarefaction Curve)，是從樣品中隨機抽取一定測序量的數據，統計它們所代表物種數目(即OTUs數目)，以數據量與物種數來構建曲線。

本研究其他的數據分析與圖形制作采用Origin 8和SPSS 16軟件完成。

2 結果與分析

2.1 不同肥料處理對百合種球鮮質量的影響

將分別施用有機肥和化肥1 a的百合種球稱取鮮質量。由圖1 可看出，EM菌發酵有機肥對增加百合鱗莖鮮質量作用顯著，相比化肥可增產76.6%。

圖中不同字母表示在P≤0.05水平上的差異顯著性 Different letters represent significant difference at the 0.05 level

2.2 不同肥料處理對百合根際土壤細菌和真菌組成及豐度的影響

從圖2-A、2-B稀釋曲線可以看出,隨著測序數據的增加，細菌和真菌稀釋曲線均基本趨于平緩，說明取樣基本合理。

Chao1指數和Shannon 指數代表了微生物群落結構的變化。由表1可以看出，百合根際土壤 Chao1指數和Shannon 指數的變化幅度真菌更為顯著，表明肥料對根際土壤真菌群落豐富度和多樣性的影響大于細菌的。其中，百合細菌和真菌Chao1指數都是lilyW大于lilyY，這說明施用化肥的土壤(lilyW)中物種豐富度大于施用有機肥的(lilyY)。Shannon指數顯示細菌的lilyY指數大于lilyW的指數，而真菌的lilyW的指數大于lilyY的指數，這說明施用有機肥(lilyY)使土壤中的細菌群落多樣性升高，真菌多樣性降低。

2.3 不同肥料處理對百合根際土壤細菌類群的影響

對測序得到的OTU結果進行分析可知(圖3)，lilyY和lilyW 2個樣品中檢測到細菌門數分別為15、14，細菌綱數分別為57、54，細菌數目分別為99、98，細菌科數分別為155、152，細菌屬數分別為175、167。在門、綱、目、科、屬水平均表現為施用有機肥處理(lilyY)大于施用化肥處理(lilyW)。

由圖4-A可以看出，在2個百合土壤處理中變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)所占比例較高，平均都大于10%。此外，綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)在2個處理中平均所占比例大于1%。其中，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在不同肥料處理中豐度變化差異較大，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在施用有機肥和無機肥處理下所占比例分別為10.6%和14.0%；而擬桿菌門(Bacteroidetes)在施用有機肥和無機肥所占比例分別為7.9%和3.9%。

對2個處理中含量最高的變形菌門(Proteobacteria)進行綱水平分析，其中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)在2個處理中含量最高，變化較小，平均占10.45%。δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)在2個處理中變化較大，其中，在有機肥中只占3.9%，而在化肥占5.3%。

圖2 相似度為0.97條件下各土壤細菌(A)和真菌(B)的稀釋曲線Fig.2 Rare faction curves of bacteria(A) and fungus(B) in each rhizosphere soil sample at cutoff level of 3%

表1 不同肥料處理百合根際土壤細菌、真菌群落多樣性指數Table 1 Bacteria and fungus diversity index in rhizosphere soil of lily in fertilizer and compost

對比施用有機肥和化肥的根際土壤細菌組成可發現，有機肥和化肥處理過的樣品中各含有一些特有屬(表2)，其中，施用有機肥的土壤(lilyY)中出現的特有屬有12個，包括鹽細菌屬(Salinibacterium)、野野村菌屬(Nonomuraea)、副球菌屬(Paracoccus)、紅長命菌屬(Rubrivivax)、索氏菌屬(Thauera)、異常球菌屬(Deinococcus)、海居菌屬(Phycicoccus)、Salinimicrobium、Wautersiella、Faecalibacterium、Akkermansia和Luteolibacter； 施用化肥的土壤(lilyW)中特有屬只有4個，包括蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)，無色桿菌屬(Achromobacter)，德沃斯氏菌屬(Devosia)和Aquicella。

不同肥料的處理還會使一些細菌屬的豐度發生不同變化(圖5-A)，其中，施用有機肥的樣品(lilyY)中有8個屬的豐度出現上調，包括不動桿菌屬(Acinetobacter)、溶桿菌屬(Lysobacter)、浮霉狀菌屬(Planctomyces)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、固氮弓菌屬(Azoarcus)、熱單胞菌屬(Thermomonas)和Pontibacter；而施用化肥的樣品(lilyW)中有5個屬出現豐度上調，包括出芽菌屬(Gemmata)，小梨形菌屬(Pirellula)、Kaistobacter、Steroidobacter和Candidatussolibacter。此外，從表3可知，不同肥料處理對硝化螺菌屬(Nitrospira)、短根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅游動菌屬(Rhodoplanes)、Niastella、鏈霉菌屬(Streptomyces)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等10個細菌屬的相對豐度沒有影響。

2.4 不同肥料對百合根際土壤真菌類群的影響

對于真菌分類(圖3)，lilyY和lilyW 2個樣品中檢測到真菌門數均為4；真菌綱數分別為7、10；真菌目數分別為12、20；真菌科數分別為15、28；真菌屬數分別為23、37。在門、綱、目、科、屬水平均表現出施化肥的樣品(lilyW)大于施有機肥樣品(lilyY)。

其中，在門水平如圖4-B所示，子囊菌門(Ascomycota)所占比例最大，lilyY占32.1%，而lilyW達到80.7%，此外所占比例較多的是不能鑒定的真菌(Unidentified)，lilyY和lilyW分別占67.0%和15.0%。

對比施用有機肥和化肥的根際土壤真菌組成可發現，有機肥和化肥處理過的樣品中各含有一些特有屬(表4)，其中，施用化肥的土壤中特有屬有16個，包括平臍蠕孢屬(Bipolaris)、光黑殼屬(Preussia)、外瓶霉屬(Exophiala)、曲霉屬(Aspergillus)、翹孢霉屬(Emericella)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、Tetracladium、Leuconeurospora、地絲霉屬(Geomyces)、念珠菌屬(Candida)、Clonostachys、 翅孢殼屬(Emericellopsis)、Wardomyces、絲蓋傘屬(Inocybe)、紅菇屬(Russula)和Geminibasidium；施用有機肥的特有屬只有2個，包括鬼傘屬(Coprinellus)和黑團孢屬(Periconia)。

圖3 不同肥料處理根際土壤細菌、真菌在各分類水平上的數量Fig.3 The number of each taxonomic levels for rhizosphere soil of fertilizer and compost

相對豐度算法：A/B×0.01,A代表在這個樣本中某個屬的克隆序列，B代表在這個樣本中所有屬的克隆序列 The clone abundance was calculated as: A/B×0.01,where A is the number of related clones detected in the genera for the library and B is the total number of all genera in the same library

不同肥料的施用還會使一些真菌屬的豐度發生不同變化(圖5-B)，其中，施用化肥的樣品(lilyW)中有15個屬出現豐度上調，包括鐮刀菌屬(Fusarium)、赤霉菌屬(Gibberella)、輪枝孢屬(Verticillium)、青霉菌屬(Penicillium)、油瓶霉屬(Lecythophora)、支頂孢屬(Acremonium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、毛殼菌屬(Chaetomium)、腐質霉屬(Humicola)、短梗蠕孢屬(Trichocladium)、柄孢殼菌屬(Podospora)、被孢霉屬(Mortierella)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)和Plectosphaerella；而施用有機肥的樣品(lilyY)中有2個屬的豐度出現上調，包括Lectera和鏈格孢屬(Alternaria)。

表2 不同肥料處理百合根際土壤細菌差異屬比較Table 2 Comparison on bacterial genera of the lily rhizosphere soil under the treatment of fertilizer and compost,respectively

注：Y表示該屬在此根際中存在；N表示該屬在此根際中不存在。表4同。Note:Y represent presence of the genus in the rhizosphere soil; N represent absence of the genus in the rhizosphere soil.The same as table 4.

表3 不同肥料處理百合根際土壤細菌豐度不變的屬Table 3 No change of bacteria relative abundance at genera level under fertilizer and compost treatments,respectively

注：各菌屬功能的描述參照汪其同等[19]的研究成果。

Note:The function description of each genus were reported by WANG Qitongetal[19],2015.

表4 不同肥料處理百合根際土壤真菌差異屬比較Table 4 Comparison of fungus genera in the lily rhizosphere soil under the treatment of fertilizer and compost treatments,respectively

相對豐度算法同圖4 The relative abundance was calculated as Fig.4

3 討 論

3.1 不同肥料處理對蘭州百合產量的影響

眾多研究表明，增施有機肥可以促進作物生長，改善品質，提高產量。EM菌是由功能各異的80余種微生物組成的一種活菌制劑。在堆肥發酵過程中加入EM菌劑，有利于微生物的迅速繁殖及糞便和秸稈的快速分解，抑制或殺死病菌、蟲卵等有害生物，并且有利于釋放出氮磷鉀和微量元素等有效養分。然而，EM有機菌肥在蘭州百合種植上鮮有使用。為驗證EM有機菌肥和常規化肥2種肥料對蘭州百合產量的影響，測定蘭州百合鱗莖的鮮質量，結果表明施用有機肥對蘭州百合增產顯著。這與之前在黃瓜[20]、番茄[21]等作物的堆肥試驗結果相似。

土壤微生物在土壤有機質和養分轉化、循環中起著極重要的作用[22]。同時，土壤微生物是土壤質量變化的敏感指標，能夠迅速對周圍環境的變化做出反應[23]。因此，不同施肥處理對微生物影響效果不同。本研究有機肥的施用提高土壤細菌的多樣性，降低土壤真菌的多樣性和豐度，尤其是降低致病真菌的多樣性和豐度，這與以前的研究結果相同[24-26]。不僅如此，研究還發現土壤中大多數微生物的數量與土壤養分、作物產量呈正相關[27]。因此，合理施用有機肥有利于維持土壤有益微生物的多樣性及活性，進而影響土壤肥力、植物的營養吸收和產量。

3.2 施用有機肥對蘭州百合根際土壤細菌群落結構的影響

土壤微生物群落受很多因素影響。土壤類型、植物類型和田間管理都是影響土壤微生物群落的主要因子[28-30]。為減少其他因素的干擾，在本試驗中，除了施用肥料不同外，其他條件(如田間管理、土壤類型、植物種類)控制都一樣。本研究發現施用EM發酵有機肥和化肥對土壤細菌群落結構影響不同，這與之前的研究結果相同[31-32]。筆者發現在施用有機肥的土壤中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對豐度有所降低。有研究報道芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相比濕潤土壤環境更適合在干燥土壤環境中生存[33]。這在一定程度上說明施用有機肥可以提高百合根際土壤的保水能力。相反，擬桿菌門(Bacteroidetes)在有機肥中的豐度顯著上升。Fierer等[34]和Goldfarb等[35]研究發現擬桿菌門(Bacteroidetes)是富營養性土壤細菌。經有機肥處理的蘭州百合根際土壤中的擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度明顯上升，表明經有機肥處理的土壤中可利用的物質增多。不僅在門水平，還發現屬水平施用有機肥相對豐度上調幅度高于施用化肥的，這表明有機肥對土壤細菌有積極的作用。

研究發現EM有機菌肥對蘭州百合土壤細菌的選擇是有一定范圍的。如硝化螺菌屬(Nitrospira)、短根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、芽孢桿菌(Bacillus)、紅游動菌屬(Rhodoplanes)、Niastella、鏈霉菌屬(Streptomyces)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等一些在土壤中有一定生態功能的菌群相對豐度并沒有因施用不同肥料而發生變化。雖然這些屬的豐度值沒有進一步的驗證，但是這些結果與Piromyou等[36]的研究結果一致。

此外，研究還發現經有機肥處理的蘭州百合根際特有細菌多為有益菌，如野野村氏菌屬(Nonomuraea)有積極的生態功能(抗菌)[37-38]。而化肥處理的根際特有細菌屬如Aquicella是包含了已報道的致病菌。這表明有機肥增加有益細菌的多樣性，也印證EM菌有機肥一定程度上能夠改善土壤的理化性質，調節土壤微生物種群。

3.3 施用有機肥對百合根際土壤真菌群落結構的影響

相對細菌來說，施用有機肥和化肥對根際真菌群落的影響不同。各個分類水平(如門、綱、目、科、屬等)上的數量在施用化肥的樣本中都高于施用有機肥的樣本。在門水平，除了不能鑒定到具體的門水平以外，所有能鑒定到門水平的相對豐度施用有機肥處理(lilyY)低于施用化肥處理(lilyW)。例如，子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度，lilyY只占32.1%，而lilyW占80.7%，施用化肥的土壤子囊菌門(Ascomycota)的豐度是施用有機肥的2倍多。說明施用有機肥顯著影響土壤的真菌群落。

鐮刀菌屬(Fusarium)是引起植物根腐的主要病原菌。而假單胞菌屬(Pseudomonas)是主要的根際細菌，有潛在控制植物病原菌的能力[39-40]，尤其對鐮刀菌屬有一定的拮抗能力[41-43]。本研究發現，在施用2種肥料的土壤中并沒有檢測到假單胞菌屬的存在，但是在施用有機肥的土壤中鐮刀菌屬的豐度卻顯著降低。這就說明有機肥不是簡單的增加拮抗菌的豐度去抑制病原菌這種一對一的常規模式，可能存在更復雜的調節機制。

另外，施用有機肥的土壤中鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)和支頂孢屬(Acremonium)等真菌屬的豐度小于施用化肥的。這與之前的研究結果相同，有機肥能夠使土壤中真菌數量減少[44]。據報道[39，45-49]這些屬包含的菌株多數為致病菌，這從另一方面說明施用有機肥對百合的生長是有利的。

致謝:感謝張寶貴博士對本研究的幫助。

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(責任編輯：潘學燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Effect of Compost on Rhizosphere Microbial Community of Lanzhou-lily Based on High Throughput Sequencing

HAO Haiting1,2,3,WANG Ruoyu1,2,3,ZHAO Xia1,2,3,WANG Yun3,4,GUO Zhihong1,2,3,ZHANG Yubao1,2,3and XIE Zhongkui1,2,3

(1.Gaolan Station of Agricultural and Ecological Experiment,Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China；2.Key Laboratory of Stress Physiology and Ecology in Cold and Arid Regions of Gansu Province,Lanzhou 730000,China；3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China；4.Key Laboratory of Desert and Desertification,Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

In this study,we investigated the rhizosphere bacteria and fungi community which fertilized by compost and chemical fertilizer respectively by the llumina Miseq platform.The result showed that compared with chemical fertilizer,the fresh production of bulbs in the first year of planting increased 76.6% when compost was used.The species annotation of the high throughput sequencing experiment showed that the diversity of bacteria on each taxonomic level in rhizosphere soil with compost was all larger than that with chemical fertilizer.However,the number at each taxonomic level of fungi with compost was less than that with chemical fertilizer.The indices of Chao1 and Shannon showed that the change of bacteria community was less than the change of fungi community.The relative abundance of some bacterial genus had no change between rhizosphere soil with compost or chemical fertilizer and most of them belong to the beneficial group.Besides,we found that some beneficial bacteria,such asNonomuraea,were present only in compost-used rhizosphere soil,but some pathogenic bacteria appeared only in the inorganic-fertilized soil,such asAquicella.The abundance of fungi genus likeFusarium,Aspergillus,PenicilliumandAcremoniumdecreased in rhizosphere soil used compost,most of which were potential pathogenic or opportunistic fungi.In conclusion,the results showed that compost could effectively affect the diversity and distribution of microorganism community in lily rhizosphere.

Lanzhou-lily；Organic compost；Rhizosphere microorganisms；llumina MiSeq sequencing

HAO Haiting,female,doctoral student.Research area:molecular microbiology.E-mail: m18919046163@163.com

WANG Ruoyu,male,Ph.D,research fellow.Research area:molecular ecology.E-mail: wangruoyu@lzb.ac.cn

日期：2017-03-03

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0833.052.html

2016-04-01

2016-05-15

國家自然科學基金(31370447)；中國科學院“百人計劃”項目(27Y127L41002)。

郝海婷，女，博士研究生，研究方向為分子微生物。 E-mail:m18919046163@163.com

王若愚，男，博士，研究員，研究方向為分子生態 。E-mail: wangruoyu@lzb.ac.cn

S-3

A

1004-1389(2017)03-0437-11

Received 2016-04-01 Returned 2016-05-15

Foundation item The National Natural Science Foundation of China(No.31370447); the Chinese Academy of Sciences under the “One Hundred Talents” Program(No.27Y127L41002).